红外频谱照射与超低频电磁场处理水对D-半乳糖致大鼠学习记忆障碍模型的改善作用

熊爱华 王 欣 吕俊华

(暨南大学药学院，广东 广州 510632)

红外频谱照射与超低频电磁场处理水对D-半乳糖致大鼠学习记忆障碍模型的改善作用

熊爱华 王 欣1吕俊华

(暨南大学药学院，广东 广州 510632)

目的探讨超低频电磁场处理水(简称频谱水)对D-半乳糖诱致大鼠学习记忆障碍模型大鼠学习记忆的改善作用及其可能机制。方法60只SD大鼠随机分为5组，即正常对照组、模型组(D-半乳糖150 mg·kg-1·d-1)、石杉碱甲组(0.031 mg·kg-1·d-1)、红外频谱照射组和频谱水组，每组12只。正常组腹腔注射等体积生理盐水，其余各组大鼠均腹腔注射D-半乳糖6 w诱致学习记忆障碍，同时各组分别灌胃(或饮用)相应受试物或红外频谱照射，采用穿梭和水迷宫法测试小鼠学习记忆能力，并测定血清、脑组织及海马体组织的超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH-Px)的活力和丙二醛(MDA)、糖基化终末产物(AGEs)含量的变化。结果红外频谱照射和频谱水均可改善模型小鼠的学习记忆能力，并提高血清和海马组织SOD、GSH-Px的活力(Plt;0.05)，降低MDA、AGEs含量(Plt;0.05)。结论红外频谱照射对D-半乳糖诱致大鼠学习记忆障碍模型有明显的改善学习记忆作用，频谱水对该模型的学习记忆有一定的改善作用，其机制可能与提高机体和大脑(尤其是海马组织)的抗氧化能力有关。

D-半乳糖；学习记忆；红外频谱照射；电磁场处理水；抗氧化能力

红外频谱照射具有抗感染、改善局部血液循环，提高机体组织的抗病、抗损伤及促进组织修复等功效。红外频谱射线的照射可提高动物体内的抗氧化酶的活力，减少氧化应激产物，提高抗氧化能力，从而提示一定强度的红外频谱照射，可能会促进脑组织的血液循环，增加脑组织的供血供氧及减少炎性物质的形成，对大脑提供一定的保护作用。由此对延缓大脑衰老，改善学习记忆能力及防治脑神经退行性病变有着积极的意义。超低频电磁场处理水(频谱水)是将普通饮用水经超低频电磁场处理后，使其物理化学特性发生改变的一种特殊处理水〔1〕。动物实验研究表明，频谱水在提高机体免疫功能，改善微循环，改善血液流变学性质，提高抗氧化作用等方面有一定的作用，提示频谱水可能在多方面、多环节对学习记忆功能存在有效的干预作用〔2，3〕。本研究采用D-半乳糖诱致大鼠学习记忆障碍模型，通过穿梭实验及Morris水迷宫实验等行为学方法及氧化和抗氧化等生化指标的变化，探讨红外频谱照射与频谱水处理对D-半乳糖诱致大鼠学习记忆障碍的改善作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体重(200±20)g，广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCXK(粤)2013-0002。动物饲养于暨南大学药学院实验技术中心，饲养鼠料、铺料均由暨南大学实验动物中心提供，正常饮食，12 h光照，12 h黑暗。

1.2药品与试剂 频谱水是由正常饮用水经骏丰频谱水治疗保健仪处理后制成；石杉碱甲(双益平，上海复旦复华药业有限公司，160502)；D-半乳糖(SIGMA公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；还原型谷胱甘肽(GSH-PX)、糖基化终末产物(AGEs)试剂盒均由武汉华美生物技术公司提供；实验所用化学试剂均为分析纯。

1.3实验仪器 骏丰频谱治疗保健仪(广东骏丰频谱股份有限公司提供，红外频谱的波长范围为3～25 μm)；ZH-CSC型穿梭实验视屏分析系统(安徽正华生物仪器设备有限公司)；Morris水迷宫(深圳瑞沃德生物科技有限公司)；酶标仪(BioTek.USA)；TGL-16G型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；KDC-16H高速台式离心机(ZONKIA科大创新科技股份有限公司)；精密移液器(法国吉尔森公司)；玻璃匀浆器(广州玻璃化学仪器厂)；电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)；ES-2000型电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)。

1.4动物分组 60只SD大鼠，适应性喂养3～5 d后，按体重随机分为5组，正常对照组、模型组(D-半乳糖，150 mg·kg-1·d-1)、石杉碱甲组(0.031 mg·kg-1· d-1)、频谱水组、红外频谱照射组，每组12只。

1.5学习记忆障碍大鼠模型的建立及模型处理 除正常对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水外，其余各组大鼠均连续腹腔注射D-半乳糖(150 mg·kg-1·d-1)6 w诱致学习记忆障碍模型，给药容积为5 ml/kg体重；在造模的同时，正常组和模型组大鼠自由饮普通水；石杉碱甲组用蒸馏水配制的石杉碱甲灌胃(灌胃容积为10 ml/kg体重)，自由饮普通水；频谱水组每天自由饮用频谱水，不饮普通水；红外频谱照射组每天给予红外频谱照射(2档)40 min，自由饮用普通水；动物连续处理共6 w。

1.6行为测定

1.6.1穿梭实验 实验穿梭箱为50 cm×25 cm×22 cm的长方形暗箱，其分为两室，中间有档板隔开，档板开启，便以大鼠自由穿梭；两室顶部均有摄像头和远红外线，底部均有可通电的铜栅。参数设为：循环次数(6次)、声音刺激时间(7 s)、电刺激时间(15 s)、循环间隔(10 s)、电流(1.2 A)、电压(50 V)。于第30天时开始每天在模型复制和给予与组别对应的相应处理1 h后，开始进行大鼠穿梭实验训练，训练时将大鼠任意放置一侧箱内3 min，让其适应环境，而后开始试验，在声音刺激7 s后，大鼠所在的实验箱自动通电，以电流刺激大鼠(而不在的那侧实验箱则无电流)，受电刺激的大鼠可能通过中间开启的档板，逃避到另一侧。如此反复刺激，训练大鼠受电刺激后的反应；每遍循环6次，连续5 d，将后3 d的实验数据平均，作统计学处理。

1.6.2Morris水迷宫 水迷宫直径100 cm，高50 cm，靶平台直径8 cm，高20 cm，向水池内注入自来水，水面高于靶平台1 cm，水中加入适量墨汁，使小鼠看不到平台及池底。水池温度维持20～22℃；摄像头位于水池正上方，电脑系统设定参数为游泳时间(60 s)和靶平台上停留时间(10 s)，选择大鼠实验模式，调整红、绿线圆圈使之分别准确框定水池及平台范围，调整池面摄像头，使其视野覆盖整个水池，为避免环境对大鼠的判断产生干扰，调整灯光以免水面反射；在水池上方约60 cm处系一红色标志物，以便大鼠定向，室内务必保持安静。实验主要分为两部分：一是定向航行实验，即设置靶平台；第36天开始，每天在模型复制和给予与组别对应的相应处理1 h后开始进行大鼠水迷宫实验训练，训练时按东、西2个方向入水，大鼠面朝池壁投入水中，记录大鼠自入水到稳定爬上靶平台所需时间(即逃避潜伏期)。大鼠爬上靶平台后让其在上站立10 s，若入水后60 s内未能找到靶平台并站立10 s，可将动物放于靶平台上10 s，站立10 s后拿下来，休息30～60 s后进行下一次训练，每遍训练循环4次，如此训练5 d，于第六天复制模型和给予与组别对应的相应处理1 h后开始正式试验，并记录相关数据以作统计学处理。二是空间探索实验，即撤除靶平台，观察大鼠在一定时间(60 s)内穿越靶平台次数、靶平台所在象限运行时间及在水迷宫周边运行时间。在完成定向航行试验后第2天，进行空间探索实验，并记录作统计学处理。

1.7生化检测

1.7.1动物血和脑组织采集与处理行为检测后，继续给予D半乳糖和相应的处理，第3天处理后1 h腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，腹主动脉取血，收集血清，冷藏静置2～3 h后3 500 r/min，离心15 min分离血清，分装，-20℃保存待测。大鼠取血后颈椎脱臼处死，断颅、剥离颅骨，在冰盘下取出全部脑组织，滤纸吸取多余的血液，分离左右两侧大脑，将右半大脑留取速冻于-20℃保存；再将左侧大脑皮层小心剥离，取出海马体组织，将海马体和剩余大脑组织分别制成10%的组织匀浆，分装，-20℃保存待测。

1.7.2血清抗氧化能力测定 按试剂盒说明书分别检测血清GSH-PX、SOD活性和AGEs、MDA的含量。

1.7.3大脑和海马体组织抗氧化能力测定 取左侧剩余的大脑组织和海马体组织分别用冰生理盐水制成10%的组织匀浆，按试剂盒说明书分别测定大脑组织SOD、GSH-Px活力和MDA、AGEs的含量。

1.8统计方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠穿梭活动的影响 D-半乳糖处理30 d时，与正常对照组比较，模型对照组电击时间明显延长，被动逃避次数明显减少(Plt;0.05)。而石杉碱甲组和红外频谱照射组与模型对照组比较均可明显降低电击时间，增加被动逃避次数(Plt;0.05)，红外频谱照射组主动逃避次数增加；频谱水组可缩短模型动物电击时间，增加被动逃避次数，而对主动逃避次数没有影响(Pgt;0.05)。见表1。

2.2红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠水迷宫活动的影响 D-半乳糖处理36 d时，与正常对照组大鼠比较，模型对照组动物定向航行潜伏期明显延长(Plt;0.05)；空间探索实验中，在原象限停留时间、靶平台穿越次数明显减少(Plt;0.05)，绕壁活动明显延长(Plt;0.01)。与模型对照组比较，给予石杉碱甲、频谱水、红外频谱照射处理30 d后，上述各组处理均可明显缩短定向航行潜伏期，明显增加在原象限停留时间、靶平台穿越次数和减少绕壁时间(Plt;0.05)。见表2。

表1 红外频谱照射和饮用频谱水对模型大鼠穿梭活动的影响

与正常组相比：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01；与模型组相比：3)Plt;0.05，4)Plt;0.01；下表同

表2 红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠水迷宫活动的影响

2.3红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠血清的影响 与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠血清SOD和GSH-PX活力明显降低，MDA、AGEs含量明显增加(Plt;0.05)。与模型对照组比较，给予石杉碱甲处理6 w后，明显提高血清SOD、GSH-PX活力，降低MDA、AGEs含量(Plt;0.05)；而频谱水、红外频谱照射处理后，对血清SOD和GSH-PX活力影响较小(Pgt;0.05)，但可明显降低血清MDA的含量(Plt;0.01)；红外频谱照射组明显降低血清AGEs含量(Plt;0.05)，频谱水对血清AGEs含量有一定的降低作用。见表3。

2.4红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠大脑组织抗氧化能力的影响 与正常对照组大鼠比较，模型对照组大鼠大脑组织SOD活力明显降低(Plt;0.05)，但MDA和AGEs含量及GSH-PX活力的影响较小(Pgt;0.05)。与模型对照组比较，石杉碱甲组明显提高大脑组织SOD的活力、降低AGEs含量；频谱水组明显提高GSH-PX活力(Plt;0.05)，红外频谱照射组对GSH-PX活力有一定的提高作用，两组均可降低大脑组织中MDA、AGEs的含量，但无统计学意义(Pgt;0.05)。见表4。

2.5红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠海马抗氧化能力的影响 与正常对照组大鼠比较，模型对照组大鼠海马组织SOD和GSH-PX活力明显降低(Plt;0.05)，MDA和AGEs含量明显增加(Plt;0.05)。与模型对照组比较，石杉碱甲组、红外频谱照射组可明显提高海马组织SOD和GSH-PX的活力，明显降低MDA和AGEs的含量(Plt;0.05)；频谱水组可明显提高海马组织GSH-PX的活力(Plt;0.01)、降低MDA的含量(Plt;0.05)。见表5。

表3 红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠血清抗氧化能力的影响

表4 红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠大脑组织抗氧化能力的影响

表5 红外频谱照射和频谱水处理对模型大鼠海马抗氧化能力的影响

3 讨 论

D-半乳糖属于醛糖，经醛糖还原酶催化还原成半乳糖醇或经氧化酶催化氧化成半乳糖醛，进一步代谢为CO2和木酮糖，并产生大量O2和H2O2，形成氧化应激损伤，导致脑神经细胞退行性病变，出现学习记忆障碍和行为活动的异常〔9～11〕。本实验采用D-半乳糖连续注射诱致大鼠学习记忆障碍模型用于实验研究，模型组大鼠学习记忆能力明显下降，体内抗氧化能力降低，氧化产物增多，处于高氧化应激状态。

新近的研究报道，大脑神经细胞的活动与外加的物理干预手段有一定的关系，Tsai团队用特殊频率的LED灯照射可消除小鼠大脑里的阿尔茨海默病的β淀粉样蛋白，并认为与增强脑内γ波活动，改善神经元之间的连接和传递有关，从而有可能用于防治AD以及改善学习记忆障碍〔7〕。而经超低频电磁场处理的频谱水，其pH发生碱移，水分子团簇结构变小，增加水的碱性及跨膜能力。本研究结果表明，红外频谱照射可明显改善记忆障碍大鼠的学习记忆行为(定向航行潜伏期明显缩短、增加穿越靶平台次数、延长在原象限运行时间，减少在水迷宫周边运行时间；穿梭过程中总电击时间缩短，电击次数减少，被动逃避次数增加)；频谱水处理对其有一定的改善作用。同时，红外频谱照射和频谱水处理可明显增加血清和大脑及海马组织中抗氧化能力(提高机体和脑SOD、GSH-PX的活力，降低MDA和AGEs的含量)。

综上所述，红外频谱照射可明显改善D-半乳糖诱致的大鼠学习记忆障碍，频谱水有一定的改善作用，其机制可能与增强机体和脑组织的抗氧化能力有关。

1Shen X.Increased dielectric constant in the water treated by extremely low frequency electromagnetic field and its possible biological implication〔J〕.J Phys，2011；329，012019.

2刘育英，赵秀梅，刘凤英，等.频谱水对大鼠白细胞粘附和微循环的影响〔J〕.中华实用医药杂志，2002；2(6)：489-90.

3刘育英，韩 岳，郑世荣，等.频谱水对大鼠全血粘度和红细胞变形性的影响〔J〕.微循环学杂志，2003；13(1)：23-4.

4Ho SC，Liu JH，Wu RY.Establishment of the mimetic aging effect in mice caused by D-galactose〔J〕.Biogerontology，2003;4(1)：15-8.

5Song X，Bao M,Li D，etal.Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model〔J〕.Mech Ageing Dev，1999;108(1999)：239-51.

6杨 军，王 静，姜 文，等.赤芍总苷对D-半乳糖衰老大鼠学习记忆及代谢产物的影响〔J〕.中国药理学通报，2001;17(6)：697-700.

7Iaccarino HF，Singer AC，Martorell AJ，etal.Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia〔J〕.Nature，2016;540(7632)：230-5.

〔2017-02-15修回〕

(编辑 李相军)

R932；R965

A

1005-9202(2017)22-5559-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.032

广东骏丰频谱股份有限公司产学研项目(JF2016-06)

1 广东骏丰频谱股份有限公司

吕俊华(1954-)，男，教授，硕士生导师，主要从事神经药理、心血管药理学实验研究。

熊爱华(1964-)，女，高级实验师，主要从事药理学实验研究。