日本囊对虾早期胚胎发育的研究

■ 湛江国联水产开发股份有限公司 蒋湘 文赵明 冉春丽 邱德全

广东海洋大学水产学院 方仪 刘建勇/文图

日本囊对虾早期胚胎发育的研究

■ 湛江国联水产开发股份有限公司 蒋湘 文赵明 冉春丽 邱德全

广东海洋大学水产学院 方仪 刘建勇/文图

日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）隶属于甲壳纲、十足目、对虾科、囊对虾属，分布在印度—西太平洋热带、非洲东海岸、马来西亚、日本、朝鲜、中国东南沿海等海域，我国90年代开始对其进行人工养殖。日本囊对虾耐干露、色泽艳丽，长途运输存活率达90%以上，通常鲜活销售，有较高的经济价值，深受水产品市场和养殖者欢迎。日本囊对虾的早期发育阶段是复杂的生命周期中最为敏感的阶段。盐度和温度是自然水体分布范围的主要决定因子，影响着日本囊对虾的生长与繁殖，尤其是影响日本囊对虾胚胎发育的最重要的非生物因素。多年来，凡纳滨对虾进口亲虾的价格节节攀升，而养殖成功率却不断下降，严重影响对虾养殖效益。因此开展日本囊对虾的人工育种和养殖技术研究，以期替代部分凡纳滨对虾的养殖，优化我国的对虾养殖结构，并为我国对虾的繁殖生物学研究提供理论基础。

1.材料与方法

1.1 亲虾来源

实验在湛江国联水产开发股份有限公司南三基地开展，水产科研车间96个孵化桶、亲虾A车间水泥池（5m×5m×1.2m）2个、产卵桶、加热棒、奥特光学生物显微镜、吸管、烧杯等。实验所用日本囊对虾亲虾来源台湾野生群体子一代，平均体长为12.48±1.28cm，体重为21.32±2.13g。

1.2 胚胎发育观察

亲虾暂养50天，室内培育，将已交配的并性腺刚开始发育的雌虾（图15）挑出单独养殖，加强营养促进性腺成熟，晚上7点挑选性腺发育Ⅳ期或以上（图14）亲虾到500L产卵桶内催产，温度30℃，盐度26.04‰，每个桶加5ppm的EDTA二钠盐消除重金属离子，产卵后移走亲虾，随时取卵进行镜检（物镜10×或40×）并拍照。

1.3 温度与盐度对日本囊对虾胚胎发育试验

设置加温与不加温2个试验组比较受精卵胚胎发育的差异，每个组设置2个重复，自然水温（26±0.36）℃，加温30℃恒定。用处理过的海水、淡水及分析纯NaCI调节盐度梯度，按等对数间隔设置5个盐度梯度，分别为15.02‰、19.20‰、24.53‰、31.65‰、40.04‰，每个组设置2个重复，将亲虾在产卵桶内刚产出的受精卵分放于不同盐度的桶中进行孵化观察，每隔一定时间取少量受精卵于显微镜下观察胚胎发育情况并拍照做记录。

2.结果与分析

2.1 胚胎发育

在水温30℃、盐度26.04‰下，日本囊对虾受精卵产出到孵化过程见图1～12。

2.1.1 卵裂

日本囊对虾刚产出的卵形状不规则，略呈三角形（图17），随后吸水成圆球形，卵径250微米左右。受精卵内部分泌一种胶状物质，吸水膨胀而形成透明的受精膜（图1），为沉性卵，未受精卵则无此过程（图13），为浮性卵。检查卵子是否受精，可以根据这一特点予以分别。当海水静止时，受精卵沉在底部容易缺氧死亡，孵化时应适当加大气量，让水体微波带动受精卵处于漂浮状态，增加与海水接触面积，提高孵化率。成熟的卵子一旦接触海水即发生皮层反应，与是否受精无关，受海水激活的卵子，卵皮层中的周边体似米粒状向外释放，卵子也由不规则形慢慢呈现圆形。日本囊对虾的卵属中黄卵，卵裂方式为全均等分裂，第1、2、3次分裂产生的分裂球尤其明显（图2、3、4），第3次卵裂产生的8个分裂球呈现正常的螺旋卵裂特征，从第1次分裂2细胞到第6次分裂产生64细胞进入到囊胚期（图7），每次分裂时间大约为 8～15min。

2.1.2 原肠期

经第7次卵裂后，大约在产卵后2.5h，囊胚的植物极开始变平，接着该处细胞向内凹陷，逐渐形成原肠腔(图8)。胚胎呈中空圆形，原肠腔形状不规则，在显微镜下不能明显观察到胚胎边缘的分裂球，可明显观察到内陷处的细胞分裂球。整个原肠期历时间约1.5h。

图1 受精卵

图2 二细胞

图3 四细胞

图4 八细胞

图5 十六细胞

图6 三十二细胞

图7 囊胚期

图8 原肠期

图9 肢牙期

图10 膜内无节幼体期

图11 膜内无节幼体期（眼点）

图12 无节幼体

图13 未受精卵

图14 性腺Ⅴ期

图15 性腺Ⅰ期图

图16 交配后纳精囊

图17 卵子

2.1.3 肢芽期

原肠胚继续发育，在其腹面两侧凸起3对芽突（图9），胚胎发育进入肢芽期。芽突继续发育形成3对附肢，第2、3对附肢又分成双肢。在该期可清楚看到包裹胚胎的第3层膜出现，即内膜。肢芽期发育的时间约6h。

2.1.4 膜内无节幼体期

胚胎的3对附肢末端出现刺状刚毛(图10、11)，逐渐长长，数量增加，腹部中央出现了1个棕色眼点。在膜内幼体前期，幼体不能抖动，随着发育进行，幼体开始抖动，频率加大，幼体以尾刺刺破内膜和外膜而出，形成无节幼体（图12）。膜内幼体发育时间约3h。

2.2 温度对日本囊对虾胚胎发育的影响

对照组孵出所需时间为（15.50±0.23）h，实验组孵化时间（12.33±0.44）h， 统计结果显示，实验组平均孵化所需时间比对照组快（3.17±0.21）h，统计分析表明存在差异显著（P＜0.05）。研究结果表明在适宜温度范围内，随着水温升高，受精卵孵化速率加快。

2.3 盐度对日本囊对虾胚胎发育的影响

表1 盐度对日本囊对虾胚胎发育的影响

盐度对胚胎发育影响如表1所示，在盐度为24.53‰～31.65‰时，孵化率高达85%以上，盐度底于15.02‰或者高于40.04‰均不能正常孵化，观察发现19.20‰组孵出少量无节幼体均不正常，幼体沉于底部，不能游动，活力很差；盐度15.02‰则不能孵出无节幼体，大部分停留在囊胚期，少数发育到肢芽期；盐度40.04‰同样不能孵出无节幼体，受精卵入水后很快发育便停止；而盐度对孵化时间的影响不显著。

3.结论

本研究发现少量发育异常的受精卵，可能是由于机械操作受伤或卵过于集中缺氧导致受精卵膜破裂，发育停止在多细胞期、肢芽期、膜内无节幼体期等阶段。另外日本囊对虾未受精卵同样可以进行卵裂，但分裂球模糊不均等，形状差异明显，且到达相同分裂期所需的时间比受精卵延迟很多，正常细胞分裂到2幼体期需要25min，而未受精卵1.5h左右，通常未受精卵分裂2次后即停止发育，因此卵子能否进行均等分裂是确定卵子是否受精的重要标准，在受精卵孵化过程中，要定时搅动水体，让底层的受精卵浮于水中，以防缺氧死亡。

温度对日本囊对虾受精卵的孵化率均有显著影响，幼体出膜时间与水温之间呈负相关关系，已有较多的报道，宋盛宪等人以野生捕获的日本囊对虾为材料，观察胚胎发育过程，结果得到32℃和20℃分别为孵化时的温度上限和温度下限，在适宜温度范围内，水温与孵化时间呈负相关；黄明哲等人研究发现，日本囊对虾28℃时的孵化时间比27.5℃时快66min；施流章研究温度、盐度对长毛对虾卵的孵化的影响，结果表明孵化期与水温有密切关系，不论在何种盐度组内（28±0.5）℃均比（24±0.5）℃孵化快。本研究结果得到（26±0.36）℃时的孵化时间比30℃时孵化时间慢（3.17±0.21）h，研究结果与以上一致，日本囊对虾属变温动物，水温高低决定新陈代谢的强弱，同样，胚胎发育速率也受温度影响较大。盐度主要影响受精孵的孵化率，而对孵化速率无显著影响，本研究中结果中得到适宜的孵化盐度范围为24.53‰～31.65‰，低于或高于某一临界值都导致受精孵不能孵化，24.53‰、31.65‰孵化时间均在15h左右，说明在适宜盐度范围内，胚胎发育速率无明显影响，日本囊对虾受精卵的孵化过程对盐度要求较为严格，盐度高低直接影响胚胎的渗透压调节。综合温度与盐度的实验结果得到：温度与发育时间的关系大于盐度与发育时间的关系，影响胚胎发育速率快慢的主要因素是温度，而不是盐度；超出正常值的盐度孵化范围，高盐度对胚胎的发育更加不利于低盐度，与其它虾类相比，中国对虾胚胎发育的盐度适宜范围为23.82‰～36.87‰，孵化率为70%～90%，显然日本囊对虾的孵化盐度范围比较窄，因此，就厂家而言，亲虾孵化期间应密切注意海水盐度的变化，避免造成损失。