百蕊草离体快繁体系技术优化

罗查梅+黄燕芬+刘向阳+曹永高+谢奇

摘 要 ：为优化百蕊草离体培养快速繁殖技术，本试验以野生百蕊草的叶片及幼嫩茎段为外植体，通过研究外植体消毒时间、不同浓度激素配比对芽苗诱导、增殖、壮苗的影响，以提高外植体诱导率和瓶苗增殖率。结果表明：（1）75%的酒精溶液消毒10 s后0.1%的氯化汞溶液浸泡8 min，外植体消毒效果最佳；（2）最適初代培养配方为MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA，增殖继代培养配方为MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.3 mg·L-1 NAA，健壮无根苗培养基配方为MS + 0.5 mg·L-1 NAA。

关键词： 百蕊草；组织培养；快速繁殖

中图分类号：Q813.1+2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.11.003

Abstract： In order to optimize the rapid reproduction technology of Thesium chinense Turcz， the experiment was conducted with the leaf and young stem of wild T. chinensis as explants， and the effects of explants disinfection time and different hormones concentrations on the bud seedling induction， proliferation and growth were studied. The results showed as follows： （1） the optimal disinfection method was sterilized 10 s with 75% alcohol， and then soaked 8 min with 0.1% HgCl2. （2） The optimal primary culture medium formula was MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA， and the optimal step-generation culture medium formula was MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.3 mg·L-1 NAA， and the optimal robust adventitious buds culture medium formula was MS + 0.5 mg·L-1 NAA. The research could improve the value-added rate of explants induction and plantlets， providing reference for T. chinense seedling propagation.

Key words： Thesium chinense Turcz； tissue culture； rapid propagation

百蕊草（Thesium chinense Turcz）为檀香科多年生草本植物，全草入药，具有清热解毒、补肾涩精等功能，同时具有治疗急性乳腺炎、肺炎、肺脓疡、扁桃体炎、上呼吸道感染、肾虚腰痛、头晕遗精、滑精等疗效[1]。近年来，由于过度采挖和自然环境遭到破坏，野生资源日益枯竭，百蕊草的产量逐渐减少，市场上百蕊草已是供不应求。百蕊草为半寄生草本植物，资源分布较为分散，且人工栽培较为困难，但临床医用量又日益增长[2-3]，为了解决此问题，人工培育百蕊草迫在眉睫。根据百蕊草野生苗与组培苗抑菌抗炎试验比较研究，百蕊草野生苗和组培苗的提取物具有等效的抗炎抑菌作用[4]。从百蕊草的研究现状来看，仍存在外植体诱导率较低、组培苗增值系数不高、长势较弱等问题，因此， 本试验通过优化和完善百蕊草快繁体系，增加瓶苗增殖系数和优等苗数量，为百蕊草快繁技术进一步发展和应用提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用百蕊草新萌发的茎段、叶作为外植体，材料采自贵阳市花溪区。

1.2 试验方法

1.2.1 丛生芽的诱导 取春季百蕊草植株上的幼嫩、健壮无病虫害茎和叶，用流水冲洗净后进行表面消毒：75%酒精溶液涮洗10 s，后用无菌水洗1～2次，再置于 0.1% 氯化汞溶液中浸泡，设置浸泡时间梯度为6，7，8，9，10 min，分别记为T1～T5，之后统一用无菌水清洗4～5次，进行初代诱导培养并统计外植体的萌发、污染、死亡、成活等诱导情况，计算其污染率、死亡率、成活率和愈伤组织诱导率，筛选能够获得最佳诱导效果的氯化汞消毒时间。

外植体切成 2 cm长的带腋芽小段接入以MS为基本培养基，含NAA 0.13 mg·L-1的不同6-BA浓度的初代诱导培养基中进行培养，6-BA浓度梯度设置为0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mg·L-1，分别记为C1～C7。经2～3周初代培养的百蕊草外植体切口处增厚变肥大产生愈伤组织，愈伤组织为绿色并开始出现芽的分化，继续培养10 d后转接到同种激素配比的新鲜MS培养基中继续培养，20 d后记录外植体出芽数，筛选能够获得最佳诱导效果的6-BA在初代培养基中的最适浓度。

1.2.2 芽的增殖继代培养 将初代培养的百蕊草愈伤组织切至带2棵芽苗 0.5～0.8 cm2 大小的团块，转接到附加不同6-BA和NAA配比的MS基本培养基中进行增殖继代培养，其中6-BA和NAA配比设置6个处理（记为组1 ～ 组6，详见表3），每种配方处理接种10瓶，每瓶接种2个团块，培养30 d时统计增殖芽数，记录芽的生长情况，并计算增殖系数，筛选最适增殖培养的6-BA和NAA配比。endprint

1.2.3 壮苗培养 将继代增殖培养得到的无菌苗转接至MS或1/2 MS为基本培养基，仅含不同浓度NAA的壮苗培养基中培养，其中基本培养基MS与不同浓度NAA组合形成5种配方（记为F1～F5，详见表4），每种配方接种10瓶，每瓶接种5棵芽苗，接种18 d左右植株开始出现芽的分枝，叶片由卷曲状开始变直变宽，培养30 d后统计百蕊草芽苗生长状况，包括叶片大小、嫩绿情况、叶柄的粗细程度及苗的高度等指标，筛选最优壮苗培养基配方。

上述试验过程中的培养条件均为培养温度（24±1） ℃，光照时间12 h·d-1，光照强度1 500～2 000 lx[5-6]。

2 结果与分析

2.1 氯化汞消毒时间对外植体生长的影响

从表1可以看出，随着氯化汞溶液消毒时间的延长，污染率呈下降趋势，成活率和愈伤组织诱导率呈先升后降的趋势，其中以消毒时间8 min时最高，诱导效果最佳；死亡率仅出现在9 min和10 min处理，且随着表面消毒时间的延长死亡率增加，说明百蕊草幼嫩茎叶外植体对0.1%氯化汞溶液的最长耐受时间为8 min，长于此处理时间百蕊草外植体芽苗的诱导将受到抑制。

2.2 6-BA对芽诱导的影响

从表2可以看出，随6-BA浓度的增加，百蕊草外植体出芽总数和平均出芽数呈现先增加后减少的趋势，其中以6-BA浓度为2.0 mg·L-1时平均出芽数最高，即C5处理组MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA的初代培养基配方诱导效果最佳（图1）。

2.3 不同激素配比对百蕊草芽苗增殖的影响

增殖培养30 d时的结果由表3可知：6-BA的浓度在0.5～2.5 mg·L-1均有促进百蕊草芽增殖的作用，其中以组3即MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.30 mg·L-1 NAA为最佳的增殖培养基配方，可以获得较高的增殖系数，且其芽长势健壮（图2a）；虽然组4获得的增殖芽数最多，但生长空间的限制使芽的长势相对组3较瘦弱（图2b）。6-BA和NAA浓度过高会抑制苗的增殖和生长；在各浓度处理中，培养30 d以后的愈伤组织逐渐出现不同程度的发黄现象，且产生的小芽苗也随之枯黄。

2.4 不同壮苗培养基对百蕊草生长的影响

由于增殖培养得到的芽苗数目较多，培养基营养成分消耗很快，生长空间不足，导致芽苗长势不统一（图3a），无效芽苗增多，因此有必要进行壮苗培养，以提高无根瓶苗的培养效益。

从表4可以看出，无论是MS还是1/2MS基本培养基，均以NAA浓度0.5 mg·L-1時，对百蕊草的壮苗效果较好，其中以壮苗配方F1组MS + 0.5 mg·L-1 NAA效果最佳，可以获得较大叶片、较粗的茎、较旺盛的长势，以及较高的分枝数和株高（图3b），说明MS基本培养基比1/2 MS更适合百蕊草的生长，NAA浓度过高不利于百蕊草的生长。

3 结论与讨论

“酒精+氯化汞”是外植体培养前处理常用的消毒方法之一[7]，由于汞离子对动植物和人体都会产生一定的毒害作用[8]，故使用氯化汞消毒的过程中除考虑其消毒效果外，还应避免对外植体生长活力的破坏[9]。试验结果显示，0.1%氯化汞消毒时间以8 min为宜，可在不破坏百蕊草生长活力的前提下降低污染率。时间过短，污染率过高进而降低了诱导率，时间过长，死亡率增加亦降低了诱导率。

在外植体离体培养中不添加其寄主植物提取液的情况下，调节细胞分裂素和生长素的比值非常重要。试验结果表明，6-BA浓度在0.5～2.5 mg·L-1，NAA浓度在0.13～0.5 mg·L-1范围内，对百蕊草芽的增殖均有促进作用，超出这个范围会抑制芽的分化生长。试验最终筛选出百蕊草离体繁殖最适初代培养配方为MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.13 mg·L-1 NAA，增殖继代培养配方为MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.3 mg·L-1 NAA，壮苗培养配方为MS + 0.5 mg·L-1 NAA，如此优化后的百蕊草快繁培养条件，具有诱导周期短、诱导率高、激素用量少、分化迅速、增殖率高的特点。同时，根据增殖苗的长势，确定百蕊草的增殖周期不宜超过30 d。由于持续增殖会导致培养基内的营养成分耗尽，生长空间拥挤使芽苗质量下降，且器官开始老化。但若增殖周期过短则芽增殖达不到顶峰，故百蕊草具体最佳增殖周期有待于进一步研究。

目前，国内对百蕊草组织培养的系统研究还相对较少，如组培苗在移栽阶段提高成活率、离体培养使用的各种试剂对百蕊草药用成分、品质的影响、在百蕊草的离体培养中不添加百蕊草寄主植物提取液的情况下，调节细胞分裂素和生长素的比值能较高效的完成离体培养的机制等。为实现百蕊草种苗的工厂化生产，处理好百蕊草作为中药材生产的种源不足情况，这些问题都有待系统深入研究。

参考文献：

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[3]罗夫来，郭巧生，王长林，等.百蕊草半寄生机制研究[J].中国中药杂志，2012，37（1）：17-22.

[4]袁艺，龙子江，许霞，等.百蕊草野生苗与组培苗抑菌抗炎实验比较的研究[J].药物生物技术，2006，13（3）：219-222.

[5]袁艺，田胜尼，戴建勇，等.白蕊草组织培养和快速繁殖的研究[J].激光生物学报，2002，11（5）：338-342.

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[8]郝辉芳，王江.汞离子对洋葱根尖细胞染色体的影响[J].山西农业科学，2015，43（10）：1237-1239.

[9]陈迪，袁媛，杨晓晶，等.皂角的组织培养[J].山西农业科学，2016，44（9）：1247-1249.endprint