贵州省3个少数民族线粒体DNA 9 bp序列缺失频率的分析研究

国学红，何 燕，张旺德，王婵娟，张 婷，官志忠

(地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室/贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵阳 550004)

·调查报告·

贵州省3个少数民族线粒体DNA 9 bp序列缺失频率的分析研究

国学红，何 燕△，张旺德，王婵娟，张 婷，官志忠

(地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室/贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵阳 550004)

目的探讨贵州省3个少数民族线粒体DNA(mtDNA)9 bp序列缺失频率情况。方法随机选取贵州省雷山县苗族(69例)、荔波县布依族(70例)、荔波县水族(44例)共183例男性血液标本，应用PCR及直接测序检测线粒体DNA 9 bp序列缺失情况。结果在贵州省3个少数民族样本中发现标准型、缺失型、3型，缺失频率最高为荔波县水族(40.91%)，雷山县苗族中检出3型1例，3个少数民族群体间mtDNA 9 bp缺失频率比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结论3个世居少数民族mtDNA 9 bp 缺失频率不同，水族的遗传变异较大，水族与苗族的亲缘关系相比水族与布依族较近。

贵州；布依族；水族；苗族；mtDNA

近年来，国内外学者利用分子生物学技术对线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA) 9 bp序列缺失标记做了一系列研究，结果发现该遗传标记有助于了解人群的亲缘关系和迁徙路线。mtDNA 9 bp序列缺失是指位于mtDNA COⅡ/tRNALys基因间小非编码区RegionⅤ的2个串联重复序列随机发生一个拷贝序列丢失的现象，可能与DNA复制过程中滑链错配有关，致使该区域核苷酸长度发生变化，最终形成4种多态：标准序列为2个串联重复的 9 bp序列，长型为标准序列前加4个CCCC，缺失型为1拷贝 9 bp序列，3型为3个重复拷贝 9 bp序列[1]。缺失型是一种最常见的多态，在不同人群中分布比例不同。研究表明，mtDNA 9 bp序列缺失具有多重源性，在亚洲人、非洲人、欧洲人等均发现了mtDNA 9 bp序列缺失现象[2]。本文旨在通过对贵州省雷山县苗族、荔波县布依族、荔波县水族的mtDNA 9 bp序列缺失频率分布情况进行研究，并结合已报道的其他民族群体来分析该地区人群的母系遗传结构特点，为相关的民族群体的起源和迁徙路线提供遗传学数据。

1 资料与方法

1.1标本采集 根据知情同意原则，随机选取贵州省雷山县苗族(69例)、荔波县布依族(70例)、荔波县水族(44例)共183例男性血液标本，采血对象均3代内无族外通婚，彼此之间无直系亲缘关系，每人取2 mL静脉血，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝。

1.2试剂 本试验所用试剂均为国产分析纯。血液基因组提取试剂盒、2×PCR Master Mix、96孔PCR反应板等购自北京天跟生化科技有限公司。PCR扩增引物合成和DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.3仪器 2720 Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)扩增目的基因片段,DU-640核酸蛋白分析仪(美国Beckman公司)检测核酸的纯度和浓度。电泳仪DYY-6C(北京六一仪器厂)和凝胶显像仪(英国Syngene公司，G：BOX)用来分辨DNA片段长度大小。

1.4方法

1.4.1模板DNA提取 外周血提取试剂盒提取基因组DNA，每个DNA样本取 2 μL加入 48 μL无菌双蒸水进行25倍稀释，紫外分光光度仪进行核酸定量，由A260和A280计算出DNA母液的浓度和纯度，取少量的DNA进行模板标化至30 μL，标化浓度为30 ng/μL作为PCR的模板，于-20 ℃保存。

1.4.2mtDNA 9 bp的PCR扩增 根据文献设计PCR引物序列，上游引物：5′-GCC CGT ATT ACC CTA TA-3′，下游引物：5′-GTA AAG AGG TGT TGG TTC-3′。PCR总反应体系为20 μL，无菌双蒸水11.0 μL，2×PCR master mix 6.0 μL，上下游引物各1 μL，DNA模版1 μL。PCR循环参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性 40 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环，最后72 ℃充分延伸5 min，4 ℃终止。PCR产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，电压120 V，时间80 min。结果发现标准型、缺失型、3型，与之相对应的PCR产物片段长度为121、112、130 bp。

1.4.3mtDNA 9 bp的PCR产物测序 随机选取标准型、缺失型、3型PCR扩增产物各6例交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果与mtDNA修订的剑桥标准序列进行比对。

1.5统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行处理。计数资料以率表示，采用χ2检验，以Plt;0.05为差异有统计意义。

2 结 果

2.1基本情况 贵州3个少数民族群体mtDNA 9 bp发现3种基因型:标准型、缺失型、3型，见图1。本次研究的3个少数民族群体标准频率依次为66.67%、75.71%、59.09%，缺失频率依次为31.88%、24.29%、40.91%，差异无统计学意义(Pgt;0.05)；仅在苗族中发现3型，频率为1.45%。

图1 贵州3个少数民族mtDNA 9 bp 3种基因型频率的分布

2.2mtDNA 9 bp PCR产物电泳图谱 在PCR检测中未发现非特异扩增，183例受检者的电泳图谱发现标准型125例，缺失型57例，3型1例，见图2。被检测的贵州3个少数民族群体样本数依次为苗族69例、布依族70例、水族44例mtDNA 9 bp缺失个数分别为22、17、18个。

M:DNA标准分子量参照物；1:3型扩增产物；2、3:标准型扩增产物；4、5:缺失型扩增产物

图2 mtDNA 9 bp PCR产物电泳结果

2.3序列测定结果 检测的6例标准型PCR扩增产物的核酸序列与mtDNA COⅡ/tRNALys基因区的小非编码区的剑桥序列一致，存在2个重复拷贝的9 bp序列，5例缺失型1拷贝9 bp序列和1例3型3个拷贝的9 bp序列。见图3。

A：缺失型;B:标准型;C:3型

图3 mtDNA 9 bp序列分析结果

3 讨 论

人类mtDNA 9 bp序列缺失标记由于具有母系遗传特点，能够忠实地记录母系进化历史，因此对于研究人类的起源、迁徙、亲缘关系等具有重要价值。有研究通过对伊朗人群的mtDNA 9 bp序列缺失频率的分析[3]，提示该人群的母系遗传结构与巴基斯坦人群、新几内亚人群较为相近，而与我国人群32%、中国台湾人群18%～40%的母系遗传结构差异较大(Plt;0.05)[4-5]。mtDNA 9 bp缺失频率分布所呈现的地理趋势能够较好地描述出史前该地区人类的迁徙路线。姚永刚等[6]对国内多个地区的少数民族和汉族群体的mtDNA 9 bp缺失频率进行研究发现，南方人群的遗传多态性高于北方人群，沿海人群高于内陆人群，提示自我国的南方进入，随后由南向北迁徙，这与柯越海等[7]得出中华民族南方起源的结论是相符的。于恩艳等[8]对我国新疆塔吉克族和柯尔克孜族人群mtDNA 9 bp多态分析发现，塔吉克族1.43%、柯尔克孜族2.86%与维吾尔族3.3%、高加索人群mtDNA 9 bp缺失频率较近；这与严江伟等[9]通过对新疆喀什地区维吾尔族 mtDNA D 环高变Ⅰ区序列研究得出维吾尔族人群与高加索人群基因发生了融合的结论相一致。本次研究的贵州3个世居少数民族为不同原始部落起源的民族群体，苗族是一个有着悠久历史的并且发源于我国的国际性民族，水族、布依族起源于古代百越。研究发现，地理位置相近的苗族与百越起源的布依族、水族的mtDNA 9 bp缺失频率分布不同，但差异无统计学意义(Pgt;0.05)，其中布依族的mtDNA 9 bp缺失频率最小，苗族次之，水族的mtDNA 9 bp缺失频率最高，提示苗族的母系遗传结构变异小于水族和布依族。

国内外学者通过对不同地域、不同民族的mtDNA 9 bp缺失频率分布状况进行分析，结果显示其分布具有明显的地域特异性和种族差异性。不同民族起源的民族群体mtDNA 9 bp缺失频率分布情况表现不一。本次研究的3个世居少数民族群体mtDNA 9 bp缺失频率均高于北方民族起源的新疆蒙古族4.0%、朝鲜族9.43%、藏族5.52%[6，10-11]，差异有统计学意义(Plt;0.05)；这符合起源于百越、苗瑶支系的民族群体mtDNA 9 bp缺失频率高于北方民族起源的民族群体的结论。荔波水族人群mtDNA 9 bp缺失频率与中国台湾高山族41.46%、汉族40%相近[12-13]，提示亲缘关系较近。笔者分析可能的原因有，高山族来源是多源性的，但主要是来自我国大陆东南沿海的古越的一支，因此与同为古越起源的水族有着相似的遗传结构；另一个原因为汉族与高山族混杂居住，民族间基因发生了交流。同一民族起源的不同民族群体mtDNA 9 bp缺失频率分布情况也是不同的，本研究的荔波布依族的mtDNA 9 bp缺失频率与广西壮族20.83%相近[14]，与荔波水族的缺失频率相比差异较大，提示该人群与广西壮族的亲缘关系较近，与荔波水族的亲缘关系较远。究其原因可能是这些具有共同史载起源的民族群体在迁徙过程中与其他民族基因融合的概率不同，也有可能群体间本身就存在遗传结构差异。

本课题组前期对贵州多个世居少数民族人群的mtDNA 9 bp的遗传多态性进行研究，结果均未发现3拷贝9 bp序列，而本次研究在雷山苗族人群中发现。3拷贝9 bp序列在国内外均有报道，研究发现伊朗人群[3]的3个9 bp拷贝的重复频率很低并且分布分散，与我国的内蒙古蒙古族、广东汉族、辽宁汉族、武汉汉族、云南汉族、新疆维吾尔族人群接近[6，15]，与葡萄牙人群相比要低，提示这种长度变异的起源在伊朗人群与我国人群中可能是各自独立起源，在葡萄牙人群中可能是共同起源。

综上所述，研究mtDNA 9 bp的遗传多态性标记，不仅有助于了解不同民族群体的母系遗传结构，而且为研究人类的起源、迁徙路线、亲缘关系提供了一定的遗传背景资料。

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Studyonfrequencyof9bpsequencedeletionofmithochondrialDNAinthreeethnicnationalitiesofGuizhouProvince*

GuoXuehong，HeYan△，ZhangWangde，WangChanjuan，ZhangTing，GuanZhizhong

(KeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseases,MinistryofEducation/KeyLaboratoryofMedicalMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo study the frequency of 9 bp sequence deletion of mithochondrial DNA in three ethnic nationalities of Guizhou Province.MethodsA total of 183 male blood samples were randomly extracted from Miao nationality(69 cases) in Leishan County,Shui nationality(44 cases) and Buyi nationality (70 cases) in Libo County.Polymerase chain reaction(PCR) and direct sequencing were used to detect the mithochondrial DNA 9 bp sequence deletion.ResultsThe standard type,deleting type and 3 type were found in the samples of 3 ethnic nationalities in Guizhou Province,the highest deletion frequency was Shui nationality(40.91%) in Libo County,1 cases of 3 type was detected in Miao nationality of Leishan County,and the mtDNA 9 bp deletion frequency had no statistical difference among 3 ethnic nationalities(Pgt;0.05).ConclusionThe frequency of mtDNA 9 bp deletion is different among three native minorities,the genetic variation in Shui nationality is larger,compared with Miao nationality genetic relationship,Shui nationality has a relatively closer affinity with Buyi nationality.

Guizhou;Buyi nationality;Shui nationality;Miao nationality;mtDNA

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.031

贵州省“2011 协同创新中心”项目(黔教合协同创新中心[2014]06号)；贵州省科技厅基金资助项目(黔科合J字[2011]2119号)。

国学红(1981-),在读硕士，主要从事疾病分子生物学研究。△

，E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn。

Q987

A

1671-8348(2017)33-4702-03

2017-05-06

2017-08-04)