GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中的异常表达及其相关机制研究

李淑群,翁 俊,莫庆荣,喻亚群

(桂林医学院附属医院肝胆胰外科,广西桂林 541000)

论著·临床研究

GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中的异常表达及其相关机制研究

李淑群,翁 俊,莫庆荣,喻亚群△

(桂林医学院附属医院肝胆胰外科,广西桂林 541000)

目的探讨肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中高尔基体蛋白73(GP73)的异常表达及其对Th1/Th2/Th17亚型分化的影响。方法选择该院2015年5月至2016年2月住院的肝癌患者50例为研究对象,50例健康志愿者作为对照。采集外周血并分离CD4+T淋巴细胞，采用实时荧光定量PCR检测CD4+T淋巴细胞中GP73表达水平；另将分选的20例健康者CD4+T淋巴细胞分别转染GP73小干扰RNA或过表达载体，实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测CD4+T淋巴细胞中GP73及核因子κB(NF-κB)表达水平,ELISA检测上清液中白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素17(IL-17)的分泌水平。结果肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中GP73 mRNA的表达与健康者相比明显上调，差异有统计学意义(Plt;0.05)。GP73过表达组NF-κB表达水平明显升高(Plt;0.05)，GP73干扰组NF-κB表达水平明显降低(Plt;0.05)。过表达GP73导致CD4+T淋巴细胞中IL-4、IL-17水平明显升高，IFN-γ水平明显降低(Plt;0.05)；沉默GP73导致CD4+T淋巴细胞IL-4、IL-17水平明显降低，IFN-γ水平明显升高(Plt;0.05)。结论GP73在肝癌患者的外周血CD4+T淋巴细胞中过表达，而GP73很有可能通过激活NF-κB参与炎症反应，导致患者体内Th1/Th2/T17失衡，促进肝癌的发生与发展。

肝肿瘤；GP73；肿瘤免疫；CD4+T淋巴细胞

在我国，肝癌是一种高发性恶性肿瘤，近年来其发生率和病死率呈现不断上升的趋势，严重威胁了人们的生命健康[1]。目前，对于肝癌的诊断和治疗效果不令人满意，因此，筛选新型肿瘤特异性标志物作为检验及治疗的靶点成为了该肿瘤研究领域的难点。高尔基体蛋白73(GP73)是近年来新发现的一种肝癌诊断指标，大量研究表明,GP73在肝癌患者血清中异常表达，证实其可能在肝癌的发生、发展中起到重要作用[2-3]。另一方面，肿瘤免疫也是癌症研究方面的一个热点，研究证实肿瘤患者辅助性T淋巴细胞(Th)的功能异常是导致肿瘤发生的重要原因[4]。截至目前，国内外尚无GP73在肝癌患者CD4+T淋巴细胞中的表达及其机制研究的相关报道。本研究通过验证GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中的表达及其对Th亚型分化的影响，从肿瘤免疫角度来探讨GP73在肝癌中的相关作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年5月至2016年2月在本院住院的肝癌患者50例为研究对象。所有患者均经病理确诊为肝癌，TNM临床分期均为Ⅰ～Ⅱ期，无淋巴结转移。所有患者未进行任何抗肿瘤治疗,排除肝炎病毒重叠感染、自身免疫病，以及其他重大器官(如心、肺等)功能异常。其中男27例，女23例，年龄47～75岁，中位年龄59岁；TNM临床分期Ⅰ期31例，Ⅱ期19例；乙型肝炎病毒(HBV)感染36例，丙型肝炎病毒(HCV)感染14例；Child-Pugh肝功能分级A级47例，B级3例；甲胎蛋白(AFP)lt;400 μg/L 35例，≥400 μg/L 15例；肿瘤直径小于或等于5 cm 32例，gt;5 cm 18例；肿瘤数目1个 45例，2个及以上 5例；低分化或未分化11例，中分化30例，高分化9例；有血管浸润24例，无血管浸润26例。另选取体检中心年龄及性别匹配的健康志愿者50例为对照，男26例，女24例，年龄46～76岁，中位年龄59岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2主要材料 GP73小干扰RNA(GP73 siRNA)及过表达(GP73 Overexpression) 载体(上海吉玛制药技术有限公司)；感受态大肠杆菌DH5α和人肝癌细胞HepG2由本实验室保存；限制性内切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)；胶回收试剂盒(Promega公司)；质粒提取试剂盒(Tiangen公司)；引物及测序由奥科公司完成。人淋巴细胞分离液(美国GE公司)；磁力架、CD4+磁珠及试剂盒、MS分离柱(德国Miltenyi Biotec公司)；RPMI 1640培养基、TRIzol试剂、胎牛血清及Lipofectamine 3000脂质体转染试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)；实时荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]；GP73、核因子κB(NF-κB)、GAPDH引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；人白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)、IL-17(南京奥青生物技术有限公司)；NF-κB及GAPDH抗体(美国Abcam公司)。

1.3方法

1.3.1CD4+T淋巴细胞的分选、鉴定、培养和转染 清晨空腹采集患者和健康者外周血各10 mL，加入淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心法分离参与者外周血单一核细胞(PBMC)。CD4+磁珠分选试剂盒按照说明书分选PBMC中的CD4+T淋巴细胞。每管细胞分选后采用流式细胞仪进行鉴定，其分选纯度均大于95%。根据后续实验的不同需求，所得CD4+T淋巴细胞或保存于-80 ℃，或进行后续培养。

根据文献提供的针对GP73 siRNA序列5′-GCC AGT GCA TCA ATC AGA T-3′，并经BLAST分析确定与其他已知基因没有同源性后,按照pSUPER.retro.neo+gfp载体的说明和要求设计合成了两条相应的DNA序列。将酶切鉴定正确的克隆测序,测序正确的相应质粒命名为psiGP73。

Flag-GP73载体的构建human gp73-BamHI-forward：5′-CGG GAT CCA TGA TGG GCT TGG GAA ACG GGC GTC-3′,human gp73-EcoRI-reverse:5′-CGG AAT TCT CAG AGT GTA TGA TTC CGC TTT CAC-3′。

将分选的部分健康人CD4+T淋巴细胞加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，分别加入GP73 siRNA (psiGP73) 或过表达(Flag-GP73)载体，使用Lipofectamine 3000按说明书流程进行转染。转染后细胞分为未转染组，GP73干扰组及GP73过表达组，在anti-CD28(1 μg /mL)和anti-CD3 (1 μg /mL)的刺激条件下，37 ℃、5%CO2条件培养72 h，收集细胞及上清液进行后续实验。

1.3.2实时荧光定量PCR检测GP73、NF-κB mRNA表达水平 -80 ℃保存的CD4+T淋巴细胞加入1 mL TRIzol,按照说明书指示提取总RNA，使用一步法实时荧光定量PCR试剂盒，逆转录合成cDNA后对目的基因进行扩增。GP73：上游引物5′-CAG CGC TGA TTT TGA GAT G-3′,下游引物5′-ATG ATC CGT GTC TGG AG-3′;NF-κB：上游引物5′-ATG TGC ATC GGC AAG TGG-3′,下游引物5′-CAG AAG TTG AGT TTC GGG TAG-3′;GAPDH：上游引物5′-AAG TAT GAC AAC AGC CTC AAG A-3′,下游引物5′-CAC CAC CTT CTT GAT GTC ATC A-3′。PCR反应条件：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环。PCR产物的相对表达采用2-△△CT法计算，以GAPDH的表达量作为内参。

1.3.3蛋白质印迹法(Western blot)检测NF-κB蛋白表达水平 用RIPA裂解液裂解细胞后，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转至PVDF膜，加入5%的脱脂牛奶封闭1 h 后，加入 NF-κB抗体4 ℃孵育过夜，洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP) 标记的二抗孵育1 h 后加入化学发光物质进行显影。

1.3.4ELISA检测IL-4、IFN-γ及IL-17水平 转染及未转染的CD4+T淋巴细胞培养72 h后，根据ELISA试剂盒说明书步骤，测定上清液中IL-4、IFN-γ、IL-17的分泌水平。

2 结 果

2.1GP73 mRNA的表达水平 肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中GP73 mRNA 的表达较对照组升高，差异有统计学意义(Plt;0.05)。见图1。

图1 GP73 mRNA的表达水平

2.2GP73 mRNA水平与肝癌患者的临床病理特征关系 将肝癌患者GP73 mRNA水平分为低表达组(低于对照组1.1倍)和高表达组(不低于对照组1.1倍)。与GP73 mRNA低表达相比，高表达患者表现较恶化的临床病理，包括TNM临床分期、Child-Pugh肝功能分级、肿瘤直径和肿瘤分化程度(Plt;0.05)；而和HBV/HCV感染、AFP、肿瘤数目及血管浸润等无明显关系(Pgt;0.05)。

图2 各组CD4+T淋巴细胞中GP73 mRNA的表达水平

2.3过表达与沉默GP73对CD4+T淋巴细胞NF-κB表达水平的影响 GP73过表达组CD4+T淋巴细胞中GP73 mRNA水平较未转染组明显上升(Plt;0.05)，而GP73干扰组较未转染组明显降低(Plt;0.05)，证明转染成功，见图2。GP73过表达组NF-κB mRNA及蛋白表达水平均明显升高(Plt;0.05)，GP73干扰组明显降低(Plt;0.05)，见图3。

图3 各组CD4+T淋巴细胞NF-κB mRNA及蛋白的表达水平

2.4患者与健康人群外周血中的IL-4、IFN-γ和IL-17的水平比较 与健康人群相比，肝癌患者外周血IL-4和IL-17的水平明显升高，IFN-γ水平明显降低(Plt;0.05)。见表3。

表3 患者与健康人群外周血中的IL-4、IFN-γ和 IL-17的水平比较

2.5过表达与沉默GP73对CD4+T淋巴细胞IL-4、IL-17和IFN-γ分泌的影响 与未转染组相比，GP73过表达组中IL-4和IL-17水平明显升高，IFN-γ水平明显降低(Plt;0.05)；而GP73干扰组有效沉默GP73后，其显示IL-4和IL-17水平较未转染组明显降低，IFN-γ水平明显上升(Plt;0.05)。见表4。

表4 过表达与沉默GP73对CD4+T淋巴细胞IL-4、 IL-17和IFN-γ分泌的影响

*Plt;0.05，与未转染组比较

3 讨 论

近年来，GP73作为肝癌特异性标记物的研究成为了癌症领域的一个热点。GP73是由Kladney等[5]在2000年发现并首次报道的，GP73是一个位于细胞内高尔基体上的Ⅱ型跨膜蛋白，研究显示在肝癌患者中GP73水平与肝脏纤维化程度呈正相关，并在患者发展成为原发性肝癌时达到高峰，证实其参与肝癌的发生和发展。此后，大量研究证实，肝癌患者血清中GP73水平明显升高并与肿瘤的发展密切相关[6-7]。本研究验证了GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中的表达，与健康人相比，GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中过表达(Plt;0.05)，揭示其可能通过影响免疫系统的功能参与肝癌的发生与进展。

本研究结果表明，和GP73 mRNA低表达组相比，高表达患者表现较恶化的临床病理，包括TNM临床分期、Child-Pugh肝功能分级、肿瘤直径和肿瘤分化程度(Plt;0.05)等，从而为临床医生在患者的诊断方面提供重要的参考，具有重要的临床意义。

肿瘤免疫是肿瘤机制研究领域的重要组成部分。大量的研究证实，免疫系统与肿瘤之间存在着错综复杂的关系。一方面，目前的许多抗肿瘤疗法通过激活各种免疫细胞及其分泌的相关因子对癌细胞进行杀伤；而另一方面，也有大量研究证实，某些免疫细胞通过各种炎症通路参与癌症的发展与发生[8-9]。研究表明，某些慢性炎症可能导致体内大量活性氧的产生与累积，从而导致胞内DNA的损伤及基因的突变，最终促进肿瘤的发生。因此，如何有效地控制炎症可能会对肿瘤的发生及治疗产生极为重要的作用。NF-κB是炎症反应中最为重要的一个转录因子，NF-κB的启动可以激活其下游信号通路，分泌各种炎性因子促进炎症的发生。在本研究中，在CD4+T淋巴细胞中过表达GP73后，NF-κB的表达也随之上调，而在沉默CD4+T淋巴细胞中的GP73可导致NF-κB表达的下调，提示GP73可能通过激活NF-κB信号通路激活炎症反应，从而促进癌症的发生和发展。

CD4+T淋巴细胞是一类Th，与其他类型淋巴细胞不同，CD4+T淋巴细胞通过分泌各种细胞因子对机体的免疫功能进行调节。CD4+T淋巴细胞根据其功能及分泌细胞因子的种类主要分为两个亚群，Th1及Th2。Th1主要调节机体细胞免疫,其代表性分泌细胞因子包括IFN-γ、IL-2等；而Th2主要调节机体体液免疫，以IL-4、IL-6等作为其标志性分泌因子[10]。而Th1通过分泌的IFN-γ抑制Th2的分化，Th2则可通过分泌IL-4抑制Th1的分化。大量研究证实，许多疾病的发生、发展与Th1/Th2的比例失调密切相关[11-12]。细胞免疫是机体免疫系统参与肿瘤发生、进展及肿瘤免疫中最主要的部分，当Th1的数量及其分泌的相关因子在患者体内占有主导地位的时候，患者的免疫系统处于抵抗状态，较为活跃，具有较强的抗肿瘤能力，而一旦Th1/Th2比例失调，Th2数量占优时，患者免疫系统处于易感状态，抗肿瘤能力较差[13]。除以上两种主要的CD4+T淋巴细胞亚群外，近年来新发现的Th17在肿瘤的发生与发展中也扮演着及其重要的角色。Th17主要分泌IL-17，在肿瘤微环境中，IL-17可能通过促进肿瘤组织新生血管的形成促进肿瘤的生长、迁移、侵袭与转移[14]，同时，IL-17促进Th17生成，抑制Th1的分化及IFN-γ的分泌[15]。在本研究中，与健康人群相比，肝癌患者外周血IL-4和IL-17的水平明显升高，而IFN-γ水平明显降低(Plt;0.05)；过表达GP73组中CD4+T淋巴细胞IL-4和IL-17水平明显上升，IFN-γ水平明显降低(Plt;0.05)；而沉默GP73后，IL-4和IL-17水平较未转染组明显降低，而IFN-γ水平明显上升(Plt;0.05)，说明GP73异常表达可能导致患者体内Th1/Th2/T17失衡，从而抑制机体抗肿瘤的相关免疫反应，促进肿瘤的发生及进展。

综上所述，GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中过表达，而GP73很有可能通过激活NF-κB参与炎症反应，导致患者体内Th1/Th2/T17失衡，促进肝癌的发生与生长。然而，GP73与Th1/Th2/T17细胞失衡作用的机制并不清楚，将在未来工作中做进一步研究。

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AbnormalexpressionofGP73inperipheralbloodCD4+Tlymphocytesofpatientswithhepatocellularcarcinomaanditsrelatedmechanism

LiShuqun,WengJun,MoQingrong,YuYaqun△

(DepartmentofHeaptobiliaryandPancreaticSurgeryt,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541000,China)

ObjectiveTo investigate the abnormal expression of Golgi protein 73(GP73) in CD4+T lymphocytes of the patients with hepatocellular carcinoma(HCC) and its influence of Th1/Th2/Th17 subtype differentiation.MethodsFifty cases of HCC hospitalized in this hospital from May 2015 to February 2016 and 50 healthy volunteers as controls were selected.Peripheral blood was collected and CD4+T lymphocytes were isolated;then the expression levels of GP73 and nuclear factor kappa-light-chain-enhancer (NF-κB) in CD4+T lymphocytes were determined by using RT-qPCR and Western blotting methods;furthermore,the secretion levels of IL-4,IL-17 and IFN-γ in the supernatants were examined by using ELISA method.ResultsGP73 mRNA expression in peripheral blood CD4+T lymphocytes in the HCC patients were significantly up-regulated compared with the healthy volunteers,the difference was statistical difference(Plt;0.05).The expression level of in GP73 overexpression group was significantly increased(Plt;0.05),while which in the GP73 interference group was significantly decreased(Plt;0.05).Over-expression of GP73 induced significant increase of IL-4 and IL-17 levels and significant decrease of IFN-γ (Plt;0.05);silencing GP73 induced marked decrease in the expression of IL-4 and IL-17 in CD4+cells and obvious increase of IFN-γ(Plt;0.05).ConclusionGP73 is over-expressed in peripheral blood CD4+T cells of HCC patients,moreover GP73 is very likely to participate in the inflammatory reaction by activating NF-κB to cause the unbalance of Th1/Th2/T17 and promote the occurrence and development of HCC.

liver neoplasms；GP73；tumor immunology；CD4+T lymphocytes

李淑群(1984-)，主治医师，硕士，主要从事肝胆胰恶性肿瘤研究。△

，E-mail:yuyaqun0222@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.33.021

R735.7

A

1671-8348(2017)33-4667-03

2017-05-13

2017-08-02)