吉林省部分地区羊泰勒虫病流行病学调查及分类鉴定

田万年 ， 薛书江 ， 贾立军 ， 张守发， 李国江

(1.吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.吉林农业科技学院 预防兽医学吉林省重点实验室 ，吉林 吉林 132101 ； 3. 延边大学农学院 ， 吉林 延吉 133002)

吉林省部分地区羊泰勒虫病流行病学调查及分类鉴定

田万年1,2， 薛书江3， 贾立军3， 张守发3， 李国江1,2

(1.吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林 吉林 132101 ； 2.吉林农业科技学院 预防兽医学吉林省重点实验室 ，吉林 吉林 132101 ； 3. 延边大学农学院 ， 吉林 延吉 133002)

为了解吉林省部分地区羊泰勒虫病的流行情况，试验采用PCR方法对采自吉林省部分地区羊血液样本235份进行羊泰勒虫检测，并对部分阳性样本进行测序分析，建立系统发育树。结果显示，羊泰勒虫阳性率为28.08%，为吕氏泰勒虫单独感染，没有检测到尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫感染。系统发育树分析表明，吉林省吕氏泰勒虫与青海分离株分布于同一分支，亲缘关系最近，与绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫亲缘关系较远。此次调查为吉林省羊泰勒虫病的综合防治提供了理论依据。

羊泰勒虫病 ； 流行病学调查 ； 聚合酶链反应 ； 18S rRNA ； 系统发育树

羊泰勒虫病是由羊泰勒虫引起的绵羊和山羊的一种经蜱传染性血液原虫病[1]。本病呈地方性流行，主要以高热、贫血和消瘦为主要临床症状，可引起外地引进羊大量死亡，慢性发病的羊产肉量和产毛量显著下降，严重影响养羊业的发展[2]。近年来，我国已报道的羊泰勒虫有3个种，即吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫[3-5]。自然感染病例多为尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的混合感染，也有少数病例单一虫种感染，绵羊泰勒虫仅在新疆有报道[6-7]。

目前，血液涂片检查在流行病学中大量应用，我国对羊泰勒虫的诊断主要以血液涂片为主。吉林省是全国重要的养羊基地，而吉林省的养羊基地主要集中在白城、松原及四平市所辖的双辽市。羊产业是吉林省畜牧产业中的支柱性产业和传统产业，养羊业已经成为当地农民增收和农业增效的重要支撑。目前，对吉林省羊泰勒虫病的流行病学调查较少，也无优势虫株及分类研究的相关报道。本试验应用PCR方法结合血液涂片检查，对采自吉林省部分地区羊泰勒虫进行检查，为该地区羊泰勒虫病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 血液样本的采集 血液样本共235份分别采自吉林省珲春市90份(2016年5月)，白城市45份(2015年4月)，松原市40份(2015年5月)和双辽市60份(2016年4月)绵羊或山羊抗凝血，同时制作了血液涂片，供姬姆萨染色镜检。血液保存于-20 ℃备用。

1.2 主要试剂 全血DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DL-2000 DNA Marker等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 基因组DNA的提取 将采集的羊抗凝血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA，抽提的DNA用60 μL TE溶解，-20 ℃保存备用。

1.4 羊泰勒虫的PCR检测 根据GenBank上登录的羊泰勒虫18S rRNA基因序列，设计种属特异性引物，引物序列见表1。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。经琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶纯化PCR产物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司序列测定。

表1 羊泰勒虫病PCR检测引物

1.5 序列比对与进化分析 将测定的梨形虫18S rRNA基因序列、以及GenBank上登录的泰勒虫和巴贝斯虫18S rRNA基因序列，建立牛羊梨形虫的系统进化树。序列依次为瑟氏泰勒虫(AF081137、AY661515、JF719834、AB016074)、环形泰勒虫(AY524666、FJ426369、EU073963、EU083801)、绵羊泰勒虫(FJ603460)、莱氏泰勒虫(AF081135)、吕氏泰勒虫(AY262117、JF719832)、尤氏泰勒虫(AY262116、JF719835)以及牛巴贝斯虫(HQ264111、AY603398)、牛卵形巴贝斯虫(LC125457、AY081192、AY603400、AY603400)、牛双芽巴贝斯虫(KM046917)、羊巴贝斯虫(AY998123)。

2 结果

2.1 血液样本PCR检测 通过对235份羊血液样本进行PCR检测，吕氏泰勒虫特异性引物扩增特异条带，而尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫特异引物未扩增出条带(结果见图1)，羊泰勒虫PCR检测阳性率为28.08%(66/235)。血液涂片染色镜检阳性率为12.76%(30/235)。

图1 吕氏泰勒虫特异引物扩增的PCR结果

吕氏泰勒虫特异引物扩增的M：DL-2000 DNA Marker ； 1～5： 部分羊样本PCR 产物 ； 6：空白对照

图2 尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫特异引物扩增的PCR结果

2.2 不同地区羊群感染羊泰勒虫病情况 采用PCR方法对分别采自珲春、白城、松原和双辽4个地区的235份血液样本进行羊泰勒虫感染情况的比较，其结果见表1。

表1 不同地区羊感染羊泰勒虫的情况

*：平均感染率，下表同

从表1可见，不同地区羊均可感染羊泰勒虫病。经统计学分析，珲春地区感染率显著高于其他3个地区，差异极显著(Plt;0.01)。

2.3 不同品种羊群感染羊泰勒虫病情况 将PCR检测的235份羊血液样本的检测结果，按不同品种分组进行比较，其结果见表2。

表2 不同品种羊群感染羊泰勒虫病情况

从表2可见，绵羊和山羊均可感染羊泰勒虫病。经统计学分析，不同品种间羊泰勒虫感染率差异不显著(Pgt;0.05)。

2.4 不同饲养方式羊群感染羊泰勒虫病情况 将PCR检测的235份羊血液样本的检测结果，按不同饲养方式分组进行比较，其结果见表3。

表3 不同饲养方式羊感染羊泰勒虫的情况

从表3可见，不同饲养方式的羊均感染羊泰勒虫病。统计学分析表明，不同饲养方式羊泰勒虫感染率差异显著(Plt;0.05)。

2.5 序列分析和系统发育树的建立 为了进一步分析吉林省羊群感染羊泰勒虫优势虫种及遗传进化关系，将本试验测得的羊泰勒虫18S rRNA基因序列与GenBank登录的巴贝斯虫和泰勒虫序列进行对比分析，应用DNAMAN软件构建系统发育树，进行系统发育分析(见图4)。结果显示，本次流行病学调查检测到的泰勒虫位于吕氏泰勒虫分支上，T.luwenshuniJilin分离株与T.luwenshuni青海分离株处在同一分支，与国内流行的尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫亲缘关系较远，吉林省羊群流行羊泰勒虫优势虫株为吕氏泰勒虫。

3 讨论

羊泰勒虫病是一类经蜱传播的血液原虫病，本病呈世界性流行，我国羊泰勒虫病流行区域逐渐扩大，国内有多个省份报道该病的流行及优势虫株[8-11]。目前，羊产业是吉林省畜牧产业中的支柱性产业和传统产业，已经成为当地农民增收和农业增效的重要支撑。为了解吉林省羊群羊泰勒虫病的感染情况，本试验应用血液涂片和PCR技术对该地区羊泰勒虫的感染率及优势虫种类进行了鉴定。结果显示，血液涂片镜检阳性率为12.76%，PCR检测阳性率为28.08%，高于血液涂片镜检，感染的优势虫种为吕氏泰勒虫，没有检测到尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。本次调查发现，羊泰勒虫呈单一病原感染，未出现吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫混合感染，这一结果与孟林明等[12]报道的吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫多呈混合感染存在差异，可能由于所处地理位置不同及传播该病的媒介蜱有关。对PCR检测的235份血液样本进行了不同地区、不同品种及不同饲养方式的比较分析。结果显示，不同地区及不同饲养方式差异显著，吉林省珲春地区感染率为45.56%，明显高于其他地区(Plt;0.05)，存在较大差异，可能与地理生态环境和跨境交易运输频率等导致感染率存在差异。放牧羊的感染率为34.53%，显著高于舍饲18.75%(Plt;0.05)，分析原因可能为放牧羊与蜱的接触几率比舍饲羊高一些。

图3 基于泰勒虫和巴贝斯虫18S rRNA基因序列的系统进化树

本试验对吉林省流行羊泰勒虫阳新样本的18S rRNA基因序列进行了克隆和遗传进化分析。结果显示，本次检测到羊泰勒虫位于吕氏泰勒虫分支上，无阳性样本位于尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫分支，表明吉林流行的羊泰勒虫为吕氏泰勒虫，丰富了羊泰勒虫流行病学资料，进一步证实了殷宏等[13]认为国内羊泰勒虫存在新种的观点。遗传进化树发现，本次检测的吕氏泰勒虫和青海分离株处于同一分支，而区别于甘肃和湖北分离株，这一结果与杨菊凤等[10]报道的我国羊泰勒虫存在地区差异性结果相一致。本次调查明确了吉林省羊泰勒虫的优势虫株和流行情况，但尚未对该地区蜱的种类进行调查，下一步加大检测样本数量，确定蜱的种类，为吉林省羊泰勒虫病的防控提供详实数据。

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EpidemiologicalsurveyandidentificationoftheileriosisingoatsandsheepinJilinProvince

TIAN Wan-nian1,2, XUE Shu-Jiang3, JIA Li-jun3, ZHANG Shou-fa3， LI Guo-jiang1,2

(1.College of Animal Science, Jilin Agricultural Scienceand Technology College, Jilin 132101, China； 2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin 132101, China； 3.College of Agriculture, Yanbian University, Yanji 133002, China)

In order to study the prevalence of theileria parasites in ovine infections in sheep. A total of 235 peripheral blood samples of sheep were collected from Jilin and detected by microscopic examination and PCR. The 18S rRNA gene was cloned from part of positive samples and used for phylogenetical analysis. As a result, Theileriosis in goats and sheep was positive in 28.08% of the samples. Phylogenetic tree analysis confirmedTheileriaspp. was most closely related toTheilerialuwenshuniQinghai strains, but more distantly related toTheileriauilenbergiandTheileriaovis. The results provide important information for prevention and control of Piroplasma of Cattle and Sheep in the region.

ovine and caprine theileriosis ； epidemiological investigation ； PCR ； 18S rRNA ； phylogenetic tree

s：ZHANG Shou-fa ； LI Guo-jiang

S852.72

A

0529-6005(2017)10-0013-04

2016-11-10

吉林省科技发展计划项目(20150623004TC)；吉林省重点学科培育项目(吉农院合字[2015]第x030号)；吉林农业科技学院种子基金项目(吉农院合字[2014]第Z07号)

田万年(1980-)，男，讲师，博士，主要从事动物寄生虫病研究，E-mail:wannian2000@hotmail.com

张守发，E-mail:shoufazhang@sina.com；李国江，E-mail:illiguojiang@126.com