糖尿病视网膜病变高糖细胞模型的建立

高娜 陶铮 段俊国

·实验研究·

糖尿病视网膜病变高糖细胞模型的建立

高娜1陶铮2段俊国2

目的建立一种高糖刺激下的糖尿病视网膜病变的细胞模型。方法分别采用不用葡萄糖浓度的培养基培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察细胞在不同时间点的细胞活性和细胞利用葡萄糖的能力,HUVEC分别与不同浓度的葡萄糖(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)共同孵育不同时间(6h、12h、24h、48h、72h),570nm处测OD值。结果各葡萄糖组对HUVEC活力的抑制率随着葡萄糖浓度的升高,作用时间的延长而升高。30 mmol/L和35 mmol/L的葡萄糖作用48h及48h以上对HUVEC活性(OD值)有明显抑制作用(Plt;0.01);各实验组葡萄糖浓度随时间延长均有不同程度的降低,且各组减低程度不同,其中30mmol/L的实验组中的葡萄糖浓度在48h和72h处降低最显著。结论30mmol/L 是筛选糖尿病视网膜病变药物细胞模型中最佳的细胞培养浓度,培养时间48h是观测药物干预效果的最佳时间点。

糖尿病视网膜病变； 高糖细胞模型； 人脐静脉内皮细胞

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病微血管病变中最重要的表现,是糖尿病的严重并发症之一,是医学领域亟待解决的致盲性眼病难题。DR发病率高,有资料显示,糖尿病患者DR的患病率高达27.29%。若不及早干预,DR将严重影响患者生存质量,加重社会负担,并带来高昂的医疗开支。

目前中医药治疗糖尿病视网膜病的优势日益凸显,其作用疗效的相关研究尚缺乏统一标准。由于细胞模型的易操作性及易重复性,使得高糖刺激下的细胞模型广泛用于中医药防治糖尿病视网膜病变的研究。但相关文献中关于如何建立高糖培养下的细胞模型还鲜有报道。

本课题拟采用人脐静脉内皮细胞为体外观察对象。如何建立最能模拟人体实际体内环境下的细胞模型是本实验的研究目的。国内外学者相继建立了多种用于糖尿病研究的细胞模型,通过控制其外环境的理化因素实现稳定条件下药物和其它作用的监测研究。

高糖培养细胞模型的建立既要符合细胞能够维持生长代谢的基本条件,又要模拟体内高糖环境下对细胞有相应损害的生长环境。对此,本课题同时采用两种方法进行考量,一是采用MTT比色法检查细胞增殖能力,二是同时测定细胞代谢的实时葡萄糖浓度,即间接反映细胞在高糖培养模式下的代谢活性,综合两者即可筛选出最佳细胞培养的高糖浓度及观测点。

1 材料与方法

1.1实验细胞

人脐静脉内皮细胞,代号:HUVEC,来源:中科院上海细胞库。

1.2主要试剂

DMEM低糖:SH30021.01(Hyclone);南美胎牛血清:FB15011,CLARK生产;MTT:M-2128(Sigma);胰酶(+EDTA):J150031(Hyclone);二甲基亚砜(DMSO):D-5879(Sigma);葡萄糖:G8270,(sigma)。葡萄糖(Glu)测试盒,F006(南京建成生物工程研究所)。

MTT配制:称取250mg MTT,避光条件下溶于50ml PBS中,在60°C水浴条件下小心晃动,使其溶解,用0.22um的微孔滤膜过滤分装,-20°C条件下长期保存。用时,无血清培养基稀释为终浓度0.5mg/ml。

1.3方法

1.3.1MTT检测细胞活性

细胞复苏后按照1:3传代培养。

取对数生长期的细胞,用PBS清洗,胰蛋白酶消化离心(1000rpm,5min)后吸除上清液,加入适量培养基使其成为单细胞悬液;用血球计数板对该单细胞悬液所含细胞进行计数,调节细胞密度3.7*10∧4/ml,100ul/孔接种于无菌96孔板中,为防止长时间培养导致蒸发,96孔板外围一圈均加适量PBS保湿;待细胞完全贴壁后吸除原培养基,每孔加入200(l不同浓度的葡萄糖溶液,每个药物浓度设6个平行孔,37℃、5%CO2恒温分别继续培养6 h、12 h、24 h、48 h、72h(表1)。

表1 葡萄糖作用分组

小心吸除原有培养液,每孔加入200ul终浓度为0.5mg/ml的MTT溶液;并轻轻晃动培养板数次,37℃、5%CO2恒温继续培养4h;吸弃液体,每孔加入150ulDMSO,取出96孔板,用酶标仪测定其在570nm处的吸光度值;

1.3.2细胞上清液中葡萄糖的浓度测定

根据3.1MTT的初步结果选择24小时,48小时及72小时为观测点。各实验组细胞培养上清液中葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢,后者在过氧化物酶的作用下,将还原性4-氨基安替比林与酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。具体操作按照葡萄糖试剂盒说明进行。

1.4统计学处理

全部数据均用 SPSS10.0 统计软件进行处理。

2 结果

2.1不同高糖浓度对细胞活性的影响

HUVEC分别与不同浓度的葡萄糖(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)共同孵育不同时间(6h、12h、24h、48h、72h),570nm处测OD值,结果如表2所示:与正常对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)相比,30 mmol/L和35 mmol/L的葡萄糖作用24h对HUVEC活性(OD值)有抑制作用(Plt;0.05),48h及72h有明显抑制作用(Plt;0.01);l0mmol/L和15mmol/L的葡萄糖作用72h、20 mmol/L的葡萄糖作用48h以上,40mmol/L的葡萄糖作用24h以上对HUVEC活力(OD值)有明显抑制作用(Plt;0.01),并呈现一定的时间和浓度依赖关系(表2)。各葡萄糖组对HUVEC活力的抑制率随着葡萄糖浓度的升高,作用时间的延长而升高(表3)。

2.2不同高糖浓度对细胞活性的影响

根据MTT细胞活性的检测结果,本研究选取24h,48h,72h三个时间点检测培养细胞上清液中葡萄糖的浓度。结果显示:各实验组葡萄糖浓度随时间延长均有不同程度的降低(表4),且各组减低程度不同(表5),其中30mmol/L的实验组中的葡萄糖浓度在48h和72h处降低最显著。

3 讨论

糖尿病视网膜病变(DR)系由于高血糖损害血管内皮细胞及细胞周细胞为基础病理改变的代谢性疾病。目前新药研究还普遍局限于动物模型,但整体动物模型筛选药物效率低成本高,因此寻找药靶基因,建立体外筛选的细胞模型,结合现代化新技术实现高通量药物筛选,将成为DR治疗的新方向。

表2 高糖对HUVEC细胞平均光密度的影响

注:各浓度葡萄糖组与空白对照组相比,*Plt;0.05;**Plt;0.01

表3 不同时间和不同浓度葡萄糖作用HUVEC的抑制率

表4 各实验组不同时间段培养基中葡萄糖浓度值(平均值)

MTT比色法可用来检测细胞增殖能力,即细胞数量;同时,细胞培养液中的葡萄糖又是细胞代谢的唯一能量来源,通过检查培养液上葡萄糖降低值可以反映细胞利用葡萄糖的能力,即可间接反映细胞代谢活性[1,2,3]。

表5 各实验组不同时间段培养基中葡萄糖浓度降低值

本实验结果显示,培养上清液中糖浓度为30mmol/L时,HUVEC利用葡萄糖的能力显著,同时,与正常对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)相比,30 mmol/L的葡萄糖作用48h及以上对HUVEC活性(OD值)有显著抑制作用(Plt;0.01);故30mmol/L是筛选DR药物细胞模型中最佳的刺激浓度,同时,为排除作用时间增长代谢产物本身对细胞产生的毒性作用,在该浓度刺激下作用48h是观察药物干预作用的最佳观测点。

由于人视网膜材料来源有限,进行人视网膜血管内皮细胞的原代培养比较困难,很难获得纯化的人视网膜血管内皮细胞,传代过程中细胞性状也容易发生改变,因此本研究选用较易生长的HUVEC来进行研究,通过在体外增加培养液中葡萄糖浓度的方法来培养 HUVEC,模拟DR中内皮细胞所处的高糖微环境。本细胞药物筛选模型具有成本低、效率高、周期短的特点,并且可重复性好,操作性强。故可以用作筛选动物模型的补充模型。

[1] 燕建锋.高糖诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤及丹参多酚酸盐对其保护作用的实验研究[J].扬州大学,2009.

[2] 李赛美,凌家杰,王志高.加味桃核承气汤及其拆方对高糖诱导HUVEC损伤培养液中ET-1、NO及ICAM-1含量的影响[J].北京中医药大学学报,2007,30(8):535-538.

[3] 王玉风,杨侠,董晓光.玻连蛋白对高糖培养的人脐静脉内皮细胞的作用[J].中华实验眼科杂志,2013,31(1):49-54.

Acellmodelfordiabeticretinopathyresearchunderhigh-glucosestimulation

GAO Na1,TAO Zheng2,DUAN Junguo2

(1.Teaching Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu Sichuan,610075;2.Ophthalmic College,Chengdu University of TCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo establish a cell model for diabetic retinopathy research under high-glucose stimulation.MethodsDifferent glucose concentration(5.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)were co-cultured with human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).MTT and the concentration of glucose in supernatant were observed at 6h、12h、24h、48h、72h respectively.ResultsThe inhibitory rate under high-glucose stimulation on HUVEC increased with the increase of glucose concentration.HUVEC co-cultured with 30 mmol/L and 35 mmol/L glucose for 48h and longer had significant inhibitory rate(Plt;0.01).Meanwhile,the glucose concentration decreased obviously in 30mmol/L group at 48h and 72h.Conclusion30mmol/L high-glucose concentration is the optimal concentration of HUVEC for DR research,and the 48h is the best time to observe the effect of drug intervention.

Diabetic retinopathy; Cell model under high-glucose stimulation; Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.03.004

R774

1.610075,四川成都,成都中医药大学附属医院/成都中医药大学临床医学院;2.610075,四川成都，成都中医药大学眼科学院

高娜,E-mail:gaonazsu@126.com