proBNP和NT-proBNP在冠心病猝死者体内的表达

曾 强 ，孙润峰 ，李 泽 ，2，翟利琴 ，2，刘明哲 ，郭相杰 ，高彩荣

（1.山西医科大学法医学院法医病理教研室，山西 太原 030001；2.山西省人民医院，山西 太原 030012）

proBNP和NT-proBNP在冠心病猝死者体内的表达

曾 强1，孙润峰1，李 泽1，2，翟利琴1，2，刘明哲1，郭相杰1，高彩荣1

（1.山西医科大学法医学院法医病理教研室，山西 太原 030001；2.山西省人民医院，山西 太原 030012）

目的研究冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）猝死者体内脑钠肽前体（pro-brain natriuretic peptide，proBNP）、N 端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）的表达变化，探讨其在冠心病猝死法医学诊断中的应用价值。方法取正常对照组、冠心病猝死组及单独冠状动脉狭窄组（每组各20例）心肌及心血样本。运用免疫组织化学染色、Western印迹法检测心肌样本中proBNP的表达，采用逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）技术检测BNP mRNA的表达，采用ELISA法检测血浆中NT-proBNP的含量。结果冠心病猝死组、单独冠状动脉狭窄组心肌组织中proBNP免疫组织化学染色均为阳性表达，正常对照组无阳性染色。冠心病猝死组、单独冠状动脉狭窄组心肌组织内proBNP蛋白、BNP mRNA相对表达量、血浆内NT-proBNP的含量较正常对照组升高（P＜0.05）。冠心病猝死组血浆内NT-proBNP含量高于单独冠状动脉狭窄组（P＜0.05）。结论心肌缺血时心肌细胞内的proBNP表达升高，测定血浆中NT-proBNP有助于判断冠心病的严重程度及鉴别冠心病猝死。

法医病理学；猝死；冠心病；脑钠肽前体；N端脑钠肽前体

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，以下简称冠心病）是心脏性猝死中常见的原因之一，以往对心肌损伤及冠心病猝死的法医学鉴定多从形态学方面入手，有时缺乏特异性。当死者伴有冠状动脉高度狭窄但仍怀疑由其他非心脏性原因致死时，难以鉴别死因。目前，脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）的应用意义已超出了原先仅作为心力衰竭诊断指标[1]的范畴。有研究[2]表明，BNP在心肌组织中的表达量能反映冠心病猝死者生前的心功能状态。脑钠肽前体（pro-brain natriuretic peptide，proBNP）为BNP的前体形式，由108个氨基酸构成，心肌细胞首先在胞内合成proBNP，然后通过高尔基体运输分泌出胞，进而裂解为BNP和N端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）。NT-proBNP是伴随BNP分子同时生成的一种无生物学活性的多肽，已与BNP一同在临床诊断心力衰竭时应用[3]。目前在法医学领域对proBNP及NT-proBNP的研究较少，因此本实验以死者心肌组织及心血作为研究对象，研究冠心病猝死者心肌组织中proBNP以及其血浆中NT-proBNP的表达及变化规律，以探讨proBNP及NT-proBNP在冠心病猝死法医学鉴定中的意义。

1 材料与方法

1.1 分组与设计

实验样本来自山西医科大学司法鉴定中心2011—2016年间受理的尸体检验案例。死后6 h内冷冻保存，72h内尸检，均经系统解剖、组织病理学检查、常见毒（药）物检验后作出法医病理学诊断。所有取得样本均经家属同意及规范化处理，所得结果仅用于医学研究。

本实验按法医病理学诊断分为正常对照组、冠心病猝死组及单独冠状动脉狭窄组（表1）。正常对照组20例，排除冠心病、心力衰竭、过敏性疾病、毒品中毒等易引起蛋白检测含量明显升高的案例；其中重度颅脑损伤10例、创伤性休克5例、CO中毒2例、青壮年猝死综合征1例、羊水栓塞1例、急性乙醇中毒1例。冠心病猝死组20例，均为冠状动脉狭窄程度≥Ⅲ级，因冠心病急性发作24h内死亡。单独冠状动脉狭窄组20例，入选标准同正常对照组，所有案例由其他非心脏性原因死亡并伴冠状动脉或其分支狭窄程度≥Ⅲ级；其中重度颅脑损伤6例、创伤性休克6例、机械性窒息4例、CO中毒1例、羊水栓塞1例、冻死1例、原发性肝癌1例。

表1 实验各组基本情况

从冠心病猝死组和单独冠状动脉狭窄组中选出13例仅有左前降支梗阻而无左旋支及右冠状动脉梗阻的案例，其中左心室前壁为缺血区，左心室后壁为非缺血区，对每例样本的缺血区和非缺血区进行Western印迹法及逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）法检测，比较两区域之间proBNP蛋白及BNP mRNA的表达差异。

1.2 样本制备

取左心室前壁及后壁心肌组织，每一块组织分两份，一份用4%多聚甲醛溶液固定，另一份保存于-80℃待检。同时取心血10mL，以离心半径10cm，1500r/min离心5min，若血浆分离效果不好，则采用2500×g离心 10 min，离心 1～2次，至血浆完全分离，取血浆置于-80℃待检。所有入选案例血浆均无明显溶血。

1.3 主要试剂及仪器

小鼠抗人proBNP单克隆抗体（英国Abcam公司），金属增强型DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗人GAPDH单克隆抗体（美国Bioworld公司），逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），NT-proBNP ELISA试剂盒（上海西唐公司）。

TissueFAXS图像软件（奥地利TissueGnostics公司），CFX ConnectTM荧光定量 PCR系统（美国Bio-Rad公司），Wellscan MK3酶标仪（美国 Thermo公司）等。

1.4 实验方法

1.4.1 心肌proBNP免疫组织化学染色

取经4%多聚甲醛溶液固定的左心室前壁及后壁心肌组织，制作厚度3μm石蜡切片。proBNP单克隆抗体以1∶400稀释染色。使用TissueFAXS图像软件进行观察。

1.4.2 Western印迹法检测心肌proBNP

取-80℃保存的心肌组织，每份100mg。研钵中加入液氮快速研磨组织至粉末状，倒入1 mL的微量离心管中，加入0.5 mL哺乳动物总蛋白提取试剂及10μL 苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），摇匀，4℃孵育 2 h，4℃下 12 000×g离心10min，取上清液。酶标仪蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转印180mA 60min转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，一抗（proBNP 单克隆抗体 1∶250）、二抗（1∶1000）孵育后，加入 Western印迹法超敏增强型化学发光（enhanced chemiluminescent，ECL）发光液进行化学发光。凝胶成像系统对PVDF膜进行成像，用VisionWorks®LS分析软件（加拿大UVP公司）对成像中蛋白条带光密度进行半定量分析。各组均以GAPDH为内参照。

1.4.3 RT-PCR法检测心肌BNP mRNA

Trizol法提取左心室前壁、后壁心肌组织总RNA，逆转录为cDNA。采用SYBR染料法在CFX ConnectTM荧光定量PCR系统上进行，每组样本均设副孔，引物序列见表2。每孔的反应体系为：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 12.5μL，基因的上、下游引物各0.5μL（BNP基因引物或GAPDH基因引物），基因DNA模板2.0μL，dH2O 9.5μL，总体积为 25.0μL。 反应条件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。在同一条件下同时扩增BNP和GAPDH基因，该系统自动给出相对表达量。

表2 RT-PCR引物序列

1.4.4 ELISA法检测血浆NT-proBNP

标准品的稀释：在酶标包被板上设标准品孔14孔，每两孔为同一浓度，制备NT-proBNP浓度分别为640、320、160、80、40、20、0 pmol/L 的标准样品（1 pmol/L=8.475pg/mL）。

加样孵育：每孔加入标准品或血浆10 μL，振荡60s，再加入第一抗体工作液40min（空白孔除外），盖紧封板膜置于室温孵育120min。

洗板：每孔加入300μL洗涤液，将反应板充分洗涤5次，在滤纸上拍干。

加酶：每孔加入酶标抗体工作液100μL，将反应板置于37℃ 10min后，重复步骤“洗板”。

显色：每孔加入底物工作液100μL，置于37℃暗处反应15min。

终止：每孔加入100μL终止液终止。

检测：30min内用Wellscan MK3酶标仪在450nm处测吸光值，并自动输出浓度值。

1.5 统计分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，运用Oneway ANOVA进行组间分析，数据由±s表示。检验水准 α=0.05。

2 结 果

2.1 心肌proBNP免疫组织化学染色

proBNP免疫组织化学染色结果见图1。冠心病猝死组可见灶性心肌坏死，proBNP染色弥漫阳性，心肌断裂处及心肌细胞边缘处染色明显加深。单独冠状动脉狭窄组心肌proBNP染色呈弥漫阳性，但较冠心病猝死组染色浅。正常对照组心肌未见明显阳性染色。

图1 心肌proBNP免疫组织化学染色 ×200

2.2 心肌proBNP Western印迹法检测结果

冠心病猝死组及单独冠状动脉狭窄组均有proBNP的表达，位于相对分子质量13000处。冠心病猝死组中的proBNP表达较强，单独冠状动脉狭窄组中的proBNP表达较弱，正常对照组几乎无proBNP的表达（图2）。由表3可见：冠心病猝死组和单独冠状动脉狭窄组proBNP表达量与正常对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；冠心病猝死组和单独冠状动脉狭窄组proBNP表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 心肌proBNP和GAPDH的Western印迹法结果

表3 各组心肌proBNP平均光密度值

缺血区（左心室前壁）proBNP平均光密度值为0.192±0.060，非缺血区（左心室后壁）proBNP平均光密度值为0.159±0.057，表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 心肌BNP mRNA的RT-PCR法检测结果

由表4可见：冠心病猝死组和单独冠状动脉狭窄组BNP mRNA相对表达量与正常对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；冠心病猝死组和单独冠状动脉狭窄组BNP mRNA相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组心肌BNP mRNA相对表达量

缺血区（左心室前壁）BNP mRNA相对表达量为2.350±1.170，非缺血区（左心室后壁）BNP mRNA相对表达量为2.096±1.015，两区域表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 血浆中NT-proBNP检测结果

正常对照组、冠心病猝死组以及单独冠状动脉狭窄组NT-proBNP检测结果见表5。正常对照组、单独冠状动脉狭窄组、冠心病猝死组血浆中NT-proBNP的含量依次递增，三组之间两两相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表5 各组血浆NT-proBNP水平

3 讨 论

BNP是主要由心室肌细胞分泌的一种多肽类激素，帮助调节心室壁舒张压力，目前已广泛用于诊断心力衰竭，并作为判断心力衰竭程度的标准使用[4-7]。proBNP是BNP的前体蛋白，心肌细胞分泌后由蛋白内切酶裂解为两部分，一部分是由32个氨基酸构成的具有生物活性的环状多肽，即传统意义上的BNP；另一部分是由76个氨基酸构成的无生物活性的直链多肽NT-proBNP。BNP与NT-proBNP一同分泌，并且释放入血[8]。正常心肌细胞内proBNP的存储量极少，当心脏应力负荷增加时，心肌细胞内的proBNP随之增加，分泌后快速裂解出BNP以帮助调节机体水钠平衡，降低心脏负荷。proBNP是急性冠状动脉综合征患者心血管疾病的重要预测因子，对治疗和预后都有重要的帮助[9]；BNP可作为室性心律失常的主要预测指标[10]，而冠心病猝死往往是因为急性心肌缺血引起的恶性心律失常或心搏骤停，作为BNP的前体蛋白，检测proBNP同样具有应用价值。本实验免疫组织化学染色结果显示，冠心病猝死组与单独冠状动脉狭窄组心肌组织中均出现阳性染色，正常对照组无阳性染色。Western印迹法检测结果显示，单独冠状动脉狭窄组和冠心病猝死组心肌组织中proBNP表达量较正常对照组增高，可能是因为冠状动脉狭窄、心肌细胞缺血会间接引起收缩功能障碍，进而促使BNP表达增加。同时，采用RT-PCR法测定心肌BNP mRNA水平，结果显示冠心病猝死组和单独冠状动脉狭窄组心肌组织中BNP mRNA的相对表达量较正常对照组增高，冠心病猝死组和单独冠状动脉狭窄组心肌组织中BNP mRNA的相对表达量差异无统计学意义，这与Western印迹法检测的结果相互印证。

有研究指出，对血液中NT-proBNP进行检测相较检测血液BNP更具优势，因为：（1）血清NT-proBNP半衰期远长于 BNP[11]；（2）NT-proBNP相较 BNP 更稳定，不易受温度、保存时间、保存条件的影响[12]；（3）BNP既可以通过胞吞作用由胞内溶酶体降解及中性内肽酶裂解，也可从肾等器官被动清除，容易被代谢分解。而NT-proBNP主要经血流量大的器官（如肾）被动清除，因此更易在体内检测到[13]。检测proBNP及NT-proBNP，可能为判断死者心肌BNP水平、分析死者心功能状态提供一个新的途径。血液NT-proBNP是很好的冠状动脉疾病死亡率的预测指标[14]，反映了冠状动脉疾病发生后一段时间内的心功能状态，近来也已被临床上用作冠状动脉疾病预后的标志物。当冠心病发生时，其在血液中迅速升高，持续时间较长，且浓度较高、较为稳定的特点优于传统冠心病心肌梗死时检测的血清学指标，如肌红蛋白、肌钙蛋白等。目前，BNP与NT-proBNP用于辅助诊断冠心病猝死的应用仅有少量报道[2，15-16]。本实验采用ELISA法检测血浆NT-proBNP结果表明，正常对照组、单独冠状动脉狭窄组、冠心病猝死组血浆中NT-proBNP的含量依次递增（P＜0.05），说明对血液NT-proBNP进一步研究将有助于冠心病猝死的鉴别。

本实验在单独冠状动脉狭窄组及正常对照组中，排除了可能造成血液NT-proBNP应激性表达快速升高的特殊死因，对照组主要为交通事故、高坠等所致重度颅脑损伤、严重外伤所致失血性休克等引起的短时间内迅速死亡的案例。有研究[17]指出，在颅脑损伤患者血液中有NT-proBNP的表达升高，原因可能是重度颅脑损伤引起严重的损伤和失血，进而导致心肌缺血缺氧，心脏功能减退，逐渐引起NT-proBNP表达增多。本实验结果显示，冠心病猝死组与单独冠状动脉狭窄组较对照组均有proBNP的表达升高，但冠心病猝死组与单独冠状动脉狭窄组之间的差异无统计学意义。该结果说明，检测死者心肌中proBNP尚不能鉴别具体的死因，而血液NT-proBNP水平结果表明，冠心病猝死组与单独冠状动脉狭窄组差异较大。且已有研究[18]认为，血液中NT-proBNP的浓度随冠状动脉梗阻分支数的增加而升高，冠状动脉粥样硬化程度、心肌坏死程度与NT-proBNP的升高密切相关[19]。因此分析认为，血浆NT-proBNP可能有助于法医学实践中鉴别冠心病的严重程度及是否为冠心病猝死。

本实验还选取了两实验组中13例左前降支梗阻而左旋支和右冠状动脉正常的心肌，对心肌组织进行Western印迹法和RT-PCR法检测，并单独对两区域的实验结果进行统计学分析，此时理论上左心室前壁为心肌缺血区，而左心室后壁为非缺血区。Western印迹法和RT-PCR结果显示，心肌缺血区（左心室前壁）的proBNP及BNP mRNA蛋白表达量和心肌非缺血区（左心室后壁）之间的差异无统计学意义。在未来的研究中，期望能够增加样本量，扩大死因范围，研究心脏性猝死时BNP、proBNP及NT-proBNP的表达变化，及其他原因死亡案例中NT-proBNP的表达量差异程度，最终建立不同死因时血液NT-proBNP的参考值范围，辅助应用于实际检案中。

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2017-01-12）

（本文编辑：黄 平）

Expression of proBNP and NT-proBNP in Sudden Death of Coronary Heart Disease

ZENG Qiang1,SUN Rui-feng1,LI Ze1,2,ZHAI Li-qin1,2,LIU Ming-zhe1,GUO Xiang-jie1,GAO Cai-rong1
（1.Department of Forensic Pathology,School of Forensic Medicine,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Shanxi Provincial People’s Hospital,Taiyuan 030012,China）

ObjectiveTo study the expression change of pro-brain natriuretic peptide （proBNP） and N-terminal pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP） in sudden death of coronary atherosclerotic heart disease,and to explore its application in forensic diagnosis.MethodsMyocardial and blood samples were collected from normal control group,sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group and single coronary stenosis group （20 cases in each group）.The expression of proBNP in myocardial samples were detected by immunohistochemical staining and Western blotting,and that of BNP mRNA were detected by reverse transcription PCR （RT-PCR）.The content of NT-proBNP in plasma were detected by ELISA.ResultsImmunohistochemical staining showed positive expression of proBNP in both sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group and single coronary stenosis group.There was no positive expression in normal control group.For sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group and single coronary stenosis group,the relative expression of proBNP protein and BNP mRNA in myocardial tissue and the NT-proBNP content in plasma were higher than that of normal control group （P＜0.05）.The NT-proBNP content in plasma of sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group was higher than that of single coronary stenosis group （P＜0.05）.ConclusionIn myocardial ischemia condition,the higher expression of proBNP in cardiac muscle cell shows that the detection of NT-proBNP in plasma can be useful to differentially diagnose the degree of coronary atherosclerotic heart disease and determine whether the sudden death due to coronary atherosclerotic heart disease.

forensic pathology;death,sudden;coronary disease;pro-brain natriuretic peptide;N-terminal pro-brain natriuretic peptide

·论 著·

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.004

1004-5619（2017）05-0476-06

山西省科技攻关资助项目（20140313015-7）；山西省回国留学人员科研资助项目（2015-050）

曾强（1992—），男，硕士研究生，主要从事猝死病理学研究；E-mail：zeng_smile@126.com

高彩荣，女，博士，博士研究生导师，主要从事猝死病理学教学研究和检案；E-mail：gaocairong5175@163.com