几丁聚糖聚合度的测定方法

张一帆

(郑州兰博尔科技有限公司，河南 郑州 450000)

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几丁聚糖聚合度的测定方法

张一帆

(郑州兰博尔科技有限公司，河南 郑州 450000)

介绍了以50%乙腈溶液分别溶解稀释壳寡糖单体标准品及检测样，并经0.22 μm滤膜过滤，分别得到壳寡糖标样溶液和检测溶液，采用高效液相色谱测定两溶液的几丁聚糖聚合度。根据色谱峰保留时间定性分析；根据峰面积定量计算得各单体的含量之和，即为几丁聚糖的含量；根据聚合度为i的几丁聚糖单体含量占几丁聚糖总含量的比值，来考察样品的聚合度分布情况。通过标准样与检测样对比分析结果可知，该方法具有重复性好、准确度良好、精确度良好、线性关系良好、操作简便等特点，适用于实际生产过程中对产品几丁聚糖聚合度的检测。

几丁聚糖 ; 聚合度 ; 高效液相色谱

0 前言

由于化学杀菌剂长期使用和使用剂量的逐年增大，病原微生物的抗药性越来越强，为了降低抗药性，增强植物的抗病害能力，细胞活化型抗性诱导剂生物制剂在农业生产中的应用日益广泛，几丁聚糖就是其中之一。几丁聚糖又名壳多糖、壳聚糖、甲壳素、海力源等，是从蟹、虾壳中应用遗传基因工程提取的动物性高分子纤维素，被科学界誉之为“第六生命要素”。几丁聚糖水剂为诱导活性强、对人畜无毒、对环境无污染、生产工艺简单和有双重功能的新一代生物制剂，它可以增强作物抵御病害的能力，增强作物抵御低温干旱的能力，对环境友好。

目前在国内登记的几丁聚糖剂型有水剂、悬浮种衣剂、可湿性粉剂、颗粒剂、悬浮剂、水乳剂等几种剂型，可用于水稻稻瘟病的防治，可以调节冬小麦、春大豆、棉花、玉米的生长，防治黄瓜、莴苣的霜霉病、白粉病、根结线虫病等，还可以防治番茄的晚疫病、柑橘的炭疽病，对苹果树的斑点落叶病也有效果，在作物的病虫害防治中应用广泛。经查询农药电子手册，几丁聚糖毒性为：急性经口LD50gt;4 640 mg/kg，急性经皮LD50gt;2 150 mg/kg；毒性为低毒。

聚合度是考察几丁聚糖聚合情况的指标，不同聚合度范围的几丁聚糖杀菌效果不同。聚合度测定有比旋光度法、超离心法、高压电泳法、凝胶色谱法，这四种方法误差较大或者操作繁琐，往往采用两种方法测定得出相同结论才能确定其聚合度。采用高效液相色谱法对聚合度分布情况进行测定，准确度较高。具体方法为：试样用50%乙腈溶解后，经过0.22 μm滤膜过滤，采用亲水键合色谱测定，根据色谱峰保留时间定性，根据峰面积定量，各单体的含量之和为几丁聚糖的含量。根据聚合度为i的几丁聚糖单体含量占几丁聚糖总含量的比值，来考察样品的聚合度分布情况。

1 实验部分

1.1仪器和试剂

高效液相色谱仪：附蒸发光散射检测器；色谱工作站；色谱柱： 250 mm×4.6 mm(i.d.)不锈钢柱，内填Click Maltose 色谱柱填充物；过滤器：滤膜孔径为0.22 μm；微量进样器：50 μL；电子天平。

水：符合GB/T 6682一级水的要求；50%乙腈溶液：量取500 mL乙腈加水稀释至1 000 mL；缓冲液：甲酸—甲酸铵，pH值为3.1，100 mmol/L；几丁聚糖标准品：氨基葡萄糖盐酸盐(≥99%)、壳二糖(≥98%)、壳三糖(≥96%)、壳四糖(≥97%)、壳五糖(≥90%)、壳六糖(≥80%)、壳七糖(≥85%)。

1.2高效液相色谱操作条件

流动相为乙腈—水(体积比为1∶1，甲酸—甲酸铵调节pH值3.1)，乙腈梯度洗脱，具体如表1所示。

表1 乙腈梯度洗脱表

流速1.000 mL/min；色谱柱温度为30 ℃；检测器：蒸发光散射(ELSD)；检测器温度：80 ℃；检测器通气量：1.5 L/min；进样量：20 μL。壳寡糖标准品色谱图示意图见图1，聚合度测定结果见图2。

图1 壳寡糖标准品色谱图示意图

图2 聚合度测定结果

图2中标注的2～15，为聚合度。聚合度为2～7的峰与标准品特征峰基本一致，即可判定样品中含有几丁聚糖。

2 测定步骤

2.1壳寡糖标样溶液的配制

分别称取壳寡糖单体标准品约0.05 g(精确到0.001 g)，加50%的乙腈溶液溶解并稀释至100 mL，混匀，经0.22 μm滤膜过滤，滤液备用。

2.2试样溶液的配制

称取试样约0.5 g(精确到0.001 g)，加50%的乙腈溶液溶解并稀释至100 mL，混匀，经0.22 μm滤膜过滤，滤液备用。

2.3测定

在上述色谱条件下将壳寡糖标准品溶液注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析，测定各标准品组分的色谱保留时间，取20 μL试样溶液注入高效液相色谱仪分析，测定各个组分保留时间和色谱峰面积，与标准品的保留时间对照，对每一个色谱峰进行归属。

2.4结果计算

几丁聚糖的聚合度(以几丁聚糖单体的含量计)X2按式(1)计算：

(1)

3 结果与讨论

3.1线性关系曲线的测定

按照上文“壳寡糖标样溶液的配制方法”，配制5个不同浓度的壳寡糖单体的标样溶液，在上述液相色谱操作条件下进行分析，每个标样溶液进样两次。壳寡糖单体标样质量表示为m，壳寡糖单体峰面积(以壳七糖计)表示为R，其结果如表2所示。

表2 聚合度测定线性关系测定结果

以m为横坐标，R(R1、R2平均值)为纵坐标绘制标准曲线，如图3所示。

图3 聚合度测定的线性关系图

从线性关系图可以看出线性关系较好，回归方程为：Y=118 446 012.6X+37 056，相关系数为0.999 8。

3.2准确度的测定

向已知质量分数的试样中加入一定量的壳寡糖单体标样，测定加入标样量，计算其回收率，试验结果见表3，由表3可见该方法准确度良好。

表3 聚合度测定准确度试验结果

3.3精密度的测定

在上述分析条件下，对同一样品分别进行5次平行测定，几丁聚糖聚合度(以i=7的含量计)分别为14.52%、14.60%、14.83%、14.71%、14.68%，平均值为14.67%，标准偏差为0.117，变异系数为0.79%，由测定结果可知该方法具有良好的精密度。

3.4与凝胶色谱法测定聚合度的比较

凝胶色谱法是采用凝胶色谱柱，以KH2PO4缓冲溶液为流动相，示差折光检测器检测，以壳寡糖标准曲线作参照，测得几丁聚糖的重均相对分子质量，然后计算聚合度。

凝胶色谱法所用试剂：壳寡糖(不同的相对分子质量)、硫酸、盐酸、氯化钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、EDTA、无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、KH2PO4。样品需要进行如下纯化过程：

原料→称重→热水抽提→离心→醇沉→离心→浓缩→除蛋白→脱色→透析→过DEAE纤维素柱→水洗脱→冻干→几丁聚糖L1。做平行试验，得几丁聚糖L2。几丁聚糖聚合度的计算方法为：几丁聚糖聚合度=几丁聚糖重均相对分子质量/几丁聚糖中糖最小单元相对分子质量。

对同一样品用两种方法进行检测，用凝胶色谱法测定的聚合度的两次分析结果分别为9.2和9.7；用液相色谱法测定的两次分析结果分别为：i=7，14.5%、14.8%；i=8，26.1%、26.5%；i=9，17.8%、17.5%；i=10，12.5%、12.1%。

由以上分析过程和分析结果可以看出，使用高效液相色谱法操作简单，更能准确直观地得知不同聚合度的几丁聚糖在产品中所占的比例。而凝胶色谱法要经过复杂的处理过程，是用相对分子质量的平均值与最小值的对比来表示聚合度，只是一个大概数值。

4 结论

采用高效液相色谱测定标准样与测试样的几丁聚糖聚合度，对比分析两者结果，表明该检测方法具有重复性好、准确度良好、精确度良好、线性关系良好、操作简便等特点。在实际生产过程中可以起到指导作用，可以准确把控产品质量，是分析几丁聚糖聚合度的较为适用的方法。

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1003-3467(2017)10-0046-03

2017-07-14

张一帆(1988-)，女，助理工程师，从事农药方面的研究工作，电话：15090757582。