利用绿色荧光蛋白GFP研究稻瘟病菌与水稻的互作

许有嫔, 廖海澄, 陈金华, 罗 櫞, 宿 加, 邹成东,李伟滔, 王 静, 马炳田, 贺 闽, 陈学伟

(四川农业大学水稻研究所, 四川省教育厅作物重大病害实验室, 杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心, 成都 611130)

利用绿色荧光蛋白GFP研究稻瘟病菌与水稻的互作

许有嫔, 廖海澄, 陈金华, 罗 櫞, 宿 加, 邹成东,李伟滔, 王 静, 马炳田, 贺 闽*, 陈学伟

(四川农业大学水稻研究所, 四川省教育厅作物重大病害实验室, 杂交水稻国家重点实验室,杂交水稻长江流域协同创新中心, 成都 611130)

稻瘟病菌Magnaportheoryzae严重威胁水稻的产量与质量,明确稻瘟病菌与水稻互作过程及机理,对防治稻瘟病具有重要意义。本研究利用稻瘟病菌常用致病菌株GUY11和ZB25,构建了绿色荧光蛋白GFP的过量表达菌株,并通过荧光显微观察菌株侵染寄主水稻过程中侵染结构的形成与发育,包括孢子萌发、附着胞形成、侵染钉形成、侵染菌丝增殖、坏死斑形成及产孢。另外,通过比较过量表达菌株对稻瘟病高抗水稻和易感水稻的侵染过程,发现侵染过程的差异主要集中于侵染钉的穿透和侵染菌丝的定殖。本研究为分析稻瘟病菌对寄主水稻的定殖规律提供了一种有效工具。

稻瘟病菌; 绿色荧光蛋白; 侵染过程; 水稻

水稻是我国主要粮食作物之一,保障水稻生产安全对我国国民经济发展至关重要[1]。稻瘟病菌Magnaportheoryzae作为水稻主要病原菌之一,严重威胁水稻的产量与质量[2]。培育及种植水稻抗病品种是防治稻瘟病主要措施,但稻瘟病菌生理小种多、繁殖变异快、流行性强,在自然条件下长期种植单一抗性品种易导致新的致病生理小种的累积及流行[3]。稻瘟病菌属于半活体寄生菌,它在水稻组织内生长繁殖力与其致病性密切相关,实时监测稻瘟病菌在寄主水稻组织内动态生长情况,将有助于揭示稻瘟病菌与水稻之间互作过程,对分析稻瘟病菌致病流行性具有重要意义。

稻瘟病菌是丝状真菌分子生物学和致病机理研究的模式菌,其侵染寄主水稻过程主要包括接触、侵入、扩展等阶段[4-8]。当前关于稻瘟病菌侵染过程的研究主要使用水稻易感材料,而对于以提高抗病性为目标的水稻抗病育种而言,急需明确稻瘟病菌与抗病品种之间的互作关系。研究病原菌与植物互作的传统方法有组织印迹法、GUS染色法和放射性标记核酸探针法等,这些非活体检测相比于活体观察手段均具有一定局限性[9-13]。来源于水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)具有荧光性质稳定、观察方便、对细胞无毒害、无物种特异性以及无需底物等优点[13],可用于直观、实时监测病原菌发生、定殖和侵染过程,目前已成为生物化学和细胞生物学研究的重要分子标记之一[14]。

本研究构建过量表达GFP的ZB25和Guy11转基因菌株,将过量表达菌株接种水稻叶片或叶鞘后,观察稻瘟病菌在寄主水稻上侵染器官的发育、侵染菌丝增殖和产孢过程,并比较GFP过量表达菌株在水稻抗感材料上侵染过程的异同。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及试剂

稻瘟病菌生理小种Guy11和ZB25、大肠杆菌EscherichiacoliDH5α菌株、水稻品种‘CO39’、‘地谷’(Digu)、‘丽江新团黑谷’(LTH)均由本实验室保存,稻瘟病菌的培养、保存及基因组提取参照常规方法[15]。载体TSC13-GFP[16]、pEASY-Blunt-BAR由实验室保存。pEASY-Blunt载体购于全式金公司(货号K41009);Taq酶、KOD-Plus-高保真酶购于TOYOBO公司;限制性内切酶购于Fermentas公司;QuantiNova SYBR Green PCR Kit 购于QIAGEN(货号208054);草铵膦购于Sigma公司(货号45520);无内毒素质粒提取试剂盒GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit购于康为世纪生物科技有限公司(货号CW2104M)。

1.2.1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR载体的构建

以Guy11基因组为模板,用引物对RP27pro-For/RP27pro-Rev扩增得到RP27基因启动子片段,同时使用引物对GFP-RP27-For/GFP-ELO-Rev-SacI,从载体TSC13-GFP中扩增GFP片段,使用引物对RP27pro-For/GFP-ELO-Rev-SacI将两个片段融合成RP27pro-GFP片段后,克隆至pEASY-Blunt载体,经SacI酶切后,切胶回收2 kb的DNA片段,最后将其连接至真菌筛选载体pEASY-Blunt-BAR的SacI位点,形成终载体pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR,验证正确后,提取pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR质粒备用。PCR引物序列见表1。

表1本研究所用的引物

Table1Primersusedinthisstudy

引物名称Primer序列(5′⁃3′)Sequence(5′⁃3′)扩增片段AmpliconRP27pro⁃ForRP27pro⁃RevCGAGCTCATAAATGTAGGTATTACCTTTGAAGATTGGGTTCCTACGRP27proGFP⁃RP27⁃ForGFP⁃ELO⁃Rev⁃SacICGTAGGAACCCAATCTTCAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGCGAGCTCGTGGAGATGTGGAGTGGGCGCGFPOsUBI＿FOsUBI＿RTTCTGGTCCTTCCACTTTCAGACGATTGATTTAACCAGTCCATGAUbiquitinMoPot2＿FMoPot2＿RACGACCCGTCTTTACTTATTTGGAAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGATMoPot2

1.2.2 PEG介导的原生质体转化

参照Talbot[17]所述方法进行稻瘟病菌原生质体转化,并使用草铵膦进行重组菌株的筛选。

1.2.3 过量表达菌株的致病性检测

采用叶片点滴接种方法检测稻瘟病菌致病性。制备过量表达菌株的孢子悬浮液,接种于生长4周的易感水稻品种‘CO39’叶片,以接种无菌水的叶片作为阴性对照,置于25℃暗培养1 d后光照培养,5 d后观察发病情况。

1.2.4 过量表达菌株的荧光显微镜观察

通过河长制管理，全市河道水环境面貌得到较大改观，各级领导重视程度得到明显提高，公众保护水环境的意识得到大幅度增强，河道水环境面貌得到明显改善。2013年，全市纳管河道环境卫生达到优秀的河道长度由1 338.5km增加到1 616.2km，同比上升20.75%；感官水质黑臭的河道长度由332.68km减少到275.92km，同比下降17.06%。全市河道劣V类水质的比例由85%下降到62%，全市河道水质总体实现好转。

制备过量表达菌株孢子悬浮液,参照文献报道方法[18]接种水稻叶片或叶鞘,通过荧光显微镜观察稻瘟病菌侵染过程。

1.2.5 水稻组织内稻瘟病菌生长量的定量PCR检测

采用文献报道方法定量检测侵染水稻叶片中的稻瘟病菌生物量[19],对侵染之后的水稻叶片,用CTAB法提取基因组DNA,再以稻瘟病菌的一段倒位重复序列MoPot2为扩增靶标、水稻基因Ubiquitin作为均一化内参基因,进行定量PCR检测。

2 结果与分析

2.1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR融合表达载体的构建

稻瘟病菌核糖体蛋白27(ribosomal protein 27)的编码基因RP27具有组成型高表达特点[18]。本研究利用该基因启动子来调控绿色荧光蛋白GFP的表达。参照材料与方法中所述方法构建并获得了稻瘟病菌GFP过量表达载体pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR(图1)。载体图谱详见图2。

图1 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR载体构建Fig.1 Construction of the vector pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR

图2 pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR载体图谱Fig.2 Restriction map of vector pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR

2.2 GFP过量表达菌株的遗传转化及筛选

Guy11为国际通用的稻瘟病菌标准菌株,它具有较强致病性,广泛用于稻瘟病菌致病机理研究[20],而ZB25是根据我国7个常规水稻稻瘟病鉴定品种而鉴别出的一个强致病性菌株[21]。本文以这两个菌株为材料构建了表达pEASY-Blunt-RP27pro-GFP-BAR载体的重组菌株。对转化获得的过量表达菌株Guy11-GFPox、ZB25-GFPox进行荧光显微镜观察,发现在营养菌丝(图3a)及孢子细胞(图3b)中均能观察到较强绿色荧光,说明GFP过量表达元件已在稻瘟病菌中稳定整合并表达。

2.3 过量表达菌株的生长及致病力检测

为分析GFP基因的转入是否影响稻瘟病菌营养生长及产孢,将野生型菌株和过量表达菌株接种于CM培养基,培养10 d后测量菌落直径及产孢量,发现过量表达菌株具有与野生型菌株一致的营养生长及产孢量(图4),这表明GFP基因的转入不影响稻瘟病菌的生长及产孢。

图3 GFP过量表达菌株的荧光分析Fig.3 Epifluorescent analysis of the Magnaporthe oryzae transformants overexpressing GFP

图4 GFP过表达菌株在CM琼脂平板上的菌丝生长及产孢Fig.4 Mycelial growth and sporulation of the transformants overexpressing GFP on CM media

菌株致病性分析结果表明,过量表达菌株及野生型菌株在叶片上产生的病斑大小之间无差异(图5a)。此外,定量PCR检测感病叶片中真菌生长量,发现过量表达菌株与野生型菌株在叶片中的定殖与侵染能力无差异(图5b，c)。上述结果表明GFP基因的转入不影响稻瘟病菌致病力。

图5 稻瘟病菌的致病力分析Fig.5 Pathogenicity of Magnaporthe oryzae

2.4 过量表达菌株侵染生活史的荧光显微观察

为分析稻瘟病菌侵染水稻过程,将易感水稻‘CO39’叶片接种过量表达菌株并进行荧光显微观察。结果表明,侵染0 h时,过量表达菌株Guy11-GFPox与ZB25-GFPox的分生孢子可黏附于水稻叶片;侵染3 h后,这两个过量表达菌株分生孢子均可萌发出芽管;随着时间推移,芽管不断延伸,并在芽管顶端膨大,分化形成侵染器官附着胞;15 h时,附着胞分化成熟,形成了黑色素(图6)。此外,叶片侵染6 d后,在离侵染点较远的叶片内未出现侵染菌丝,而在叶脉内已出现许多侵染菌丝(图7),这表明稻瘟病菌在水稻叶片中定殖时可能优先沿叶脉扩展;还发现叶片上侵染位点附近的部位极易形成水浸状斑点,并且该斑点在侵染菌丝还没扩展到的地方就已形成(图7)。

图6 荧光显微观察稻瘟病菌侵染水稻叶片的过程Fig.6 Epifluorescent microscopy examination of the life cycle of Magnaporthe oryzae invading rice leaves

图7 GFP过量表达菌株侵染水稻叶片后的病斑观察Fig.7 Rice leaves infected with the GFP overexpressing strain

为进一步分析稻瘟病菌在水稻组织内的生长定殖情况,本研究采用透明的水稻叶鞘作为侵染材料,来观察侵染钉及侵染菌丝在水稻组织中的生长。荧光显微观察表明,侵染24 h之内,稻瘟病菌在叶鞘与叶片上的孢子萌发和附着胞形成过程相一致;侵染24 h之后,叶鞘内可见附着胞已分化形成侵染钉,并且侵染钉在植物细胞内形成多重分支的次生侵染菌丝;侵染48 h后侵染菌丝大量扩增,已占据多个植物细胞(图8)。叶片侵染5～6 d后形成坏死斑,并在病斑处产生分生孢子梗及侵染单元分生孢子(图6)。因此,GFP过量表达菌株可用于荧光观察稻瘟病菌侵染循环各个阶段的发育结构,包括分生孢子附着于寄主表面(图9a)、分生孢子萌发及附着胞的产生(图9b)、侵染钉的形成(图9c)、侵染菌丝的产生(图9d)、叶片病斑形成(图9e)及病斑处产孢结构(图9f)。

图8 荧光分析水稻叶鞘中稻瘟病菌的附着胞和侵染菌丝的发育Fig.8 Epifluorescent analysis of the development of appressorium and infectious hyphae of Magnaporthe oryzae in rice sheathes

图9 稻瘟病菌侵染循环Fig.9 Infection cycle of Magnaporthe oryzae

2.5 过量表达菌株对感病和抗病水稻品种的侵染过程观察

目前已有大量报道阐述稻瘟病菌对亲和性易感水稻的侵染过程[4, 7, 22],但有关稻瘟病菌与非亲和性高抗水稻之间的互作过程还不是十分清楚。为分析稻瘟病菌在亲和与非亲和水稻品种侵染过程之间的差异,我们以易感水稻品种‘丽江新团黑谷’(LTH)和高抗水稻品种‘地谷’(Digu)为材料,比较了过量表达菌株Guy11-GFPox对两者的侵染过程。结果表明,侵染5 h时,两个水稻品种上均可观察到分生孢子萌发形成附着胞(图10);16 h时,两种水稻叶片及叶鞘上的附着胞均可分化成熟并黑色素化(图10)。这表明稻瘟病菌侵染易感和高抗水稻品种时,在穿透植物表皮之前的发育过程没有明显差异。

图10 GFP过量表达菌株对感病和抗病水稻材料的侵染过程观察Fig.10 Infection processes of GFP overexpression strain in susceptible and resistant rice

侵染叶鞘至24 h时,易感水稻‘丽江新团黑谷’叶鞘中大部分附着胞产生侵染钉,刺破水稻表皮而使侵染菌丝进入植物内部组织细胞,但在高抗水稻‘地谷’叶鞘中,只有极少数附着胞可形成侵染钉;36 h时,易感水稻中侵染菌丝已占满初次侵染的植物细胞,并侵入临近植物细胞,而在高抗水稻中仅见极短的侵染菌丝,而且侵染菌丝不能在高抗水稻细胞内扩增(图10a)。上述结果表明,稻瘟病菌对易感和高抗水稻侵染过程的差异主要集中于侵染钉的穿透和侵染菌丝的增殖。

3 讨论

建立对稻瘟病菌生理小种的快速准确示踪方法,了解稻瘟病菌侵染过程及规律,将有利于水稻抗病品种的筛选和抗病性监测[23]。GFP具有荧光性质稳定、观察方便、无毒害等优点,将其作为报告基因,应用十分广泛。本研究构建了过量表达GFP的稻瘟病菌重组菌株,并利用过量表达菌株观察了稻瘟病菌对水稻的动态侵染过程,发现侵染水稻时,稻瘟病菌经历孢子附着、萌发、分化附着胞、形成侵染钉及侵染菌丝、分化产生分生孢子梗和孢子(图6～9),这一侵染过程与前人报道的稻瘟病菌在水稻组织中的黏附[24]、萌发、穿透[25]、定殖[26]过程相一致。本研究丰富了GFP标记在稻瘟病菌研究中的应用,为进一步分析稻瘟病菌在水稻中定殖、扩展规律,揭示稻瘟病菌的生物学特性与病害发生之间的关系提供了一种有效的示踪手段。

本研究发现稻瘟病菌侵染水稻表皮早期发育过程,包括分生孢子萌发、芽管形成、附着胞发育及成熟,在水稻抗感材料上没有明显差异。但在穿透及定殖植物表皮阶段,稻瘟病菌可穿透易感水稻表皮并大量增殖,但对高抗水稻的穿透增殖能力却显著受到抑制(图10)。这表明,抗病品种对稻瘟病菌的防卫反应主要针对附着胞穿透和侵染菌丝定殖生长,这与Li等[27]的研究中提到抗病水稻可识别早期的附着胞发育,并启动防卫反应的论述一致。抗病材料中含有相应抗性基因,当受到病原菌侵染后,水稻启动抗性基因的表达,以抵御病原菌的入侵。

本研究还发现稻瘟病菌在水稻叶片中优先选择叶脉处扩展增殖(图7),而且叶片侵染位点的组织周围易形成水浸状病斑(图7)。稻瘟病菌定殖植物组织时,其生长依赖于宿主产生的营养物质。我们推测稻瘟病菌沿着植物运输通道叶脉生长,可能更有利于获取营养。此外,前人研究表明[28],稻瘟病菌在水稻组织细胞中分泌BAS1和BAS4等多种效应蛋白,以调控宿主细胞免疫反应。本研究观察到侵染叶片上形成水浸状病斑,其原因可能是侵染菌丝生长过程中所分泌的效应蛋白影响了宿主的免疫力,从而以水浸状斑点表现出来。后续研究解析稻瘟病菌如何调控水稻免疫力及致病过程,将有助于深化对稻瘟病菌与水稻分子互作机理的认识。

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(责任编辑： 田 喆)

FluorescentmicroscopicanalysisoftheplantinfectionprocessofMagnaportheoryzaeusinggreenfluorescentprotein

Xu Youpin, Liao Haicheng, Chen Jinhua, Luo Yuan, Su Jia, Zou Chengdong,Li Weitao, Wang Jing, Ma Bingtian, He Min, Chen Xuewei

(CollaborativeInnovationCenterforHybridRiceinYangtzeRiverBasin,StateKeyLaboratoryofHybridRice,KeyLaboratoryofMajorCropDiseasesofSichuanDepartmentofEducation,RiceResearchInstitute,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

Blast disease caused by the fungusMagnaportheoryzaeleads to tremendous loss in production and quality of rice worldwide. To effectively control rice blast disease, we need to understand the infection process and pathogenic mechanism ofM.oryzae. Green fluorescent protein (GFP) has been widely used as a labelling tool in life science research. Here we report the construction of a vector overexpressing GFP and the successful introduction of the vector into two commonly usedM.oryzaestrains Guy11 and ZB25. By using the resulting fungal transformants overexpressing GFP, we observed the successional and dynamic plant infection processes byM.oryzaeincluding conidial germination, germ tube elongation, formation of an appressorium and penetration peg, proliferation of infection hyphae within the rice tissue, appearance of blast lesion, development of conidiophore and production of conidia at the blast lesion. We also compared the infection processes ofM.oryzaebetween interactions with compatible rice host and incompatible host, and found thatM.oryzaeunderwent normal appressorium on both rice hosts. After the formation of appressorium,M.oryzaewas able to develop penetration peg and invasive hyphae within rice tissue in a compatible interaction, but lost these abilities in an incompatible interaction. Our study proves that theM.oryzaeexpressing GFP facilitates our observation of the processes ofM.oryzaeinfection on rice plant, thus providing an effective tool for examination of pathogen-plant interaction.

Magnaportheoryzae; green fluorescent protein (GFP); infection process; rice

2017-02-24

2017-03-29

国家自然科学基金(31301626);四川省科技厅国际合作项目(2014HH0066);国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX0800903B,2016ZX08001002)

* 通信作者 E-mail:cqhemin_1983@163.com

S 435.111.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.008