不同产地壮药夜香牛中木犀草素的含量测定

谭小明 周小雷 周雅琴 赵以民 余丽莹

西南濒危药材资源开发国家工程实验室/广西药用植物园，广西 南宁 530023

药物研究

不同产地壮药夜香牛中木犀草素的含量测定

谭小明 周小雷 周雅琴*赵以民 余丽莹

西南濒危药材资源开发国家工程实验室/广西药用植物园，广西 南宁 530023

目的：建立高效液相色谱法(HPLC)测定广西不同产地壮药夜香牛中木犀草素的含量。方法：采用HPLC法对10个不同产地的夜香牛药材中木犀草素的含量进行检测。采用Alltima C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-乙腈(1∶1)为流动相A；0.5%磷酸为流动相B；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：350 nm。结果：广西10个不同产地夜香牛药材中木犀草素含量在0.00200%～0.00997 %之间。结论：本实验方法过程简单、测定结果可靠、且检测的重复性好，可作为研究壮药夜香牛质量标准的方法。

壮药；夜香牛；木犀草素；高效液相色谱法；产地

夜香牛[VernoniaCinerea(L.) Less.]属菊科(Compositae)斑鸠菊属(Vernonia)一年生或多年生草本植物，广泛分布于浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、云南和四川等省区，印度至中南半岛、日本、印度尼西亚、非洲也有，常见于山坡旷野、荒地、田边、路旁[1]。以干燥全草或根入药，是壮族习用的药材，《岭南采药录》早有记载[2-3]；其味苦、辛，性凉，具有清热疏风、除湿解毒等功效，主治感冒发热、黄疸型肝炎及毒蛇咬伤等[4]。药理研究表明，夜香牛的植物浸提物体外对大肠杆菌等多种人体病原菌具有不同程度的抑制作用，对正常小鼠小肠具有一定的促进推进作用[5]。木犀草素是其主要化学成分之一[6-7]。在广西，夜香牛分布于全区各地，各地药材质量存在差异，给临床用药带来一定的影响。因此，本研究以木犀草素含量为指标，考察10个不同产地采集夜香牛药材中的木犀草素含量，旨在为广西夜香牛药材的质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱系统(包括四元梯度洗脱泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，美国安捷伦公司)；SK5200H型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，频率53KHz，功率200W)；CP2250D电子分析天平(Sartorius)；101-1型电热鼓风干燥箱(上海沪南科学仪器联营厂)；W201型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.2 材料 木犀草素对照品(批号 16030941，纯度≥98%，同田生物技术股份有限公司)。甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)，其他试剂均为分析纯。10批夜香牛药材为广西南宁、大新、永福、全州等地采集。经广西中医药大学韦松基教授鉴定为菊科植物夜香牛V.cinerea(L .)干燥的全草。凭证标本存放于广西药用植物园中药资源鉴定中心。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱：Alltima C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A：甲醇-乙腈(1:1)，流动相B：0.5%磷酸，梯度洗脱(30%～60%A，0～30min)；流速1.0 mL/min；检测波长：350 nm；柱温：30℃。在上述条件下进行测定，夜香牛样品中木犀草素峰峰形对称，与其他组分分离度好，理论塔板数≥10000，分离度gt;1.5，结果见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素对照品5.66 mg置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成0.2264 mg·mL-1的对照品溶液。精密吸取上述木犀草素储备液1.5 mL于10mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成每1mL含木犀草素0.03396mg的对照品溶液。

2.2.2 供试样品液的制备 取夜香牛药材粉末(过2号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇40 mL，超声提取2次，第1次60 min，第2次30 min，过滤，合并滤液，蒸干，用色谱甲醇溶解后，转移至10 mL量瓶并定容，摇匀，滤过，滤液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察 精密吸取浓度为0.03396 mg/mL的木犀草素对照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，依次注入液相色谱仪，测定峰面积；以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=4636.074X+0.714(r2=0.9998)，结果表明，木犀草素在0.06792～0.47544 μg与峰面积线性关系良好。

2.4 精密度试验 精密吸取木犀草素对照品溶液(质量浓度0.03396 mg/mL)8μL，重复进样6次，分别测定峰面积，RSD为1.11%(n=6)，结果表明该仪器精密度良好，仪器性质稳定，所测样品数据可靠，可用于样品含量测定。

2.5 稳定性试验 取夜香牛药材粉末2g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在于0、2、4、6、8、12 h进样，测定木犀草素峰面积，其RSD值为1.22%，结果表明在12h内测试样品稳定可靠。

2.6 重复性试验 取同一批药材粉末6份，每份2 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，根据含量测定结果计算RSD为3.11%(n=6)，表明该方法制备供试样品重现性良好，证明该方法可行。

2.7 回收率试验 取已知含量的样品粉末6份，各约1g，精密称定。分别精密加入浓度为0.03396 mg·mL-1的木犀草素对照品溶液1.6mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。表明本方法的准确度较好。见表1。

表1 夜香牛中木犀草素加样回收率实验

2.8 样品测定 10批夜香牛样品的含量测定结果见表2。

表2 夜香牛中木犀草素含量测定结果 (n=3)

3 讨论

壮药夜香牛在广西民间常被用于治疗感冒发热、黄疸型肝炎、毒蛇咬伤。另外，其70%的提取液对鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤Pc-12细胞具有良好的神经生长因子(NGF)诱导活性。化学研究表明，夜香牛全草以黄酮类(如木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、洋芹素等)、倍半萜类和酚类成分为主；根中以甾类和三萜类化合物居多[6-7]。木犀草素的药理活性研究表明其具有抗菌、抗氧化、抗辐射等多种作用[8]；这与夜香牛的民间药用功效相互对应；此外，夜香牛药材中的香叶木素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷等化学成分也具有抗菌和有利于动物消化系统蠕动的作用[4-5]。综合夜香牛的化学和药理作用研究，本研究选择以木犀草素作为夜香牛含量测定的指标性成分。

在流动相条件优化过程中，参考文献[9]以甲醇-0.2 %磷酸溶液(44∶56)为流动相，但实验研究中样品峰干扰的成分较多，各峰分离度达不到分离要求，这可能与检测仪器和色谱柱的差异有关。研究通过比较筛选，结果显示，用流动相A为甲醇-乙腈(1∶1)，流动相B为0.5%磷酸，梯度洗脱(30%～60%A，0～30min)系统效果较好，木犀草素峰的峰形对称，且与其他组分分离度好，理论塔板数较高，因此，选用此系统作为夜香牛中木犀草素含量测定的流动相。

中药材的质量与其生长环境密切相关[10]。夜香牛广泛分布于广西全区各地，但是不同产地的夜香牛药材中木犀草素的含量存在差异。研究所采集的10个产地的夜香牛药材样品中，以桂北的广西恭城县、灌阳县和全州县的夜香牛木犀草素含量最高，分别达到0.00997%、0.00987%和0.00956%；其次是桂西南的广西那坡县、靖西县和大新县；夜香牛木犀草素含量最低的产地是广西隆林县。由此可见，生长环境对于夜香牛的质量也存在一定的影响，但具体是哪些因子产生此类影响，还有待进一步研究。

研究以高效液相色谱法为检测工具，建立了广西不同产地夜香牛药材中主要成分木犀草素的测定方法；较以往的研究方法，具有样品制作和检测过程简单、测定结果可靠、且检测的重复性好，这一方法为壮药夜香牛中木犀草素的质量控制提供数据参考，同时也可为其它类似中药材中木犀草素的含量检测提供依据。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志(第74卷)[M]．北京：科学出版社，1985：38.

[2]江苏新医学院. 中药大辞典(上册)[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977: 916.

[3]《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编(第二版，上册)[M]．北京：人民卫生出版社，1996：483.

[4]国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草 [M].上海：上海科学技术出版社，1999：1000．

[5]李育浩,吴清和,李茹柳,等. 伤寒草药理研究[J]. 中药材,1993(5):31-33

[6]朱华旭,唐于平,闵知大,等.夜香牛全草的生物活性化学成分研究(Ⅱ)[J]. 中国中药杂杂志，2009(21):2765-2767.

[7]朱华旭,唐于平,潘林梅,等.夜香牛全草的生物活性成分研究[J]. 中国中药杂志,2008(16):1986-1988.

[8]张芳芳, 沈汉明, 朱心强. 木犀草素抗肿瘤作用的研究进展[J]. 浙江大学学报(医学版)，2006,35(5): 573-578.

[9]陈黄保. HPLC法测定夜香牛中木犀草素的含量[J]. 中国药师，2009, 12(9): 1262-1263.

[10]朱波,刘京晶,斯金平,等. 铁皮石斛内生真菌对宿主组培苗生长与代谢成分的影响[J].中国中药杂志, 2016(9): 1602-1607.

Determination of Luteolin in the Zhuang Medicine Vernonia cinerea (L.) Less. from Different Habitats

TAN Xiaoming ZHOU Xiaolei ZHOU Yaqin*ZHAO Yimin YU Liying

National Engineering Laboratory of Southwest Endangered Medicinal Resources Development,National Development and Reform Commission, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023, China

Objective To determinate the content of luteolin in Zhuang medicineVernoniacinerea(L.) Less. from different habitats of Guangxi by HPLC. Methods The luteolin in ten different habitats ofV.cinereawas dominated by HPLC using Alltima C18chromatographic column (4.6 mm×250 mm，5 μm). Methanol-Acetonitrile(1∶1)and 0.5% phosphoric acid were used as mobile phase，which flowing at 1.0 mL·min-1(with the gradient elution at 30 %～60 %, 0 to 30 min ).The detection wavelength was 350 nm and column temperature was at 30 ℃. Results The content of luteolin in ten different habitats ofV.cinereawas 0.0020 %～0.00997 %. Conclusion The HPLC method for the determination of luteolin contain inV.cinereais simple, accurate and reproducible, which may be used for the study quality standard ofV.cinerea.

Zhuang Medicine；VernoniaCinerea；Luteolin；HPLC；Habitats

R284.1

A

1007-8517(2017)20-0018-03

广西重大专项计划资助项目(桂科重1598005-10)；国家自然科学基金资助项目(81360682)；广西科学基金资助项目(2015GXNSFDA139012 、2016GXNSFBA380007)。

谭小明(1979-)，男，博士研究生，副研究员，研究方向为药用植物菌根生物学。E-mail:txm1978@126.com

周雅琴(1979-)，女，学士，助理研究员，研究方向为药物分析。E-mail：zhouyaqin2009@126.com

2017-09-06 编辑：程鹏飞)