HPLC法同时测定水栀子中栀子苷和西红花苷-I的含量

赵江平 牛 忻,2 杨 群 李淑娟 韦凤爽 郝丽莉 刘江云*

1.苏州大学医学部药学院，江苏 苏州 215123；2.菏泽市食品药品检验检测研究院中药科，山东 菏泽 274000

HPLC法同时测定水栀子中栀子苷和西红花苷-I的含量

赵江平1牛 忻1,2杨 群1李淑娟1韦凤爽1郝丽莉1刘江云1*

1.苏州大学医学部药学院，江苏 苏州 215123；2.菏泽市食品药品检验检测研究院中药科，山东 菏泽 274000

目的：建立水栀子中两种主要组分的双波长同时含量测定方法。方法：采用Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ 色谱柱(250mm × 4.6mm，5μm)；流动相为甲醇- 0.1% 乙酸溶液梯度洗脱；流速1.0mL/min；检测波长238nm(1)和440nm(2)，测定水栀子中栀子苷(1)、西红花苷-I(2)的含量。结果：两种组分色谱分离良好，栀子苷、西红花苷-I的线性范围分别为50.16～501.6μg/mL(r=0.9999)、10.13～101.3μg/mL(r=0.9997)，加样回收率分别为97.77%、97.39%。结论：该测定方法快速、准确，可为水栀子的质量分析方法提供参考。

水栀子；HPLC；栀子苷；西红花苷-I

栀子为茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实，广泛分布于长江以南的江西、广西、云南、浙江、福建、台湾等地。栀子是我国药食两用的传统中药，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效[1]，现已用于清开灵注射液、牛黄上清丸、龙胆泻肝丸、清火栀麦片等多种中成药。研究表明，栀子主要含有环烯醚萜、西红花苷、绿原酸酯、果胶、油脂等类成分[2]。栀子苷是栀子清热解毒的主要有效组分之一，其可通过和某些氨基酸结合转化为食用色素栀子蓝和栀子红。栀子中的西红花苷类成分(栀子黄)与西红花中的藏红花素组分的结构和主成分组成均类同，具有抗氧化损伤、治疗或预防心脑血管疾病及癌症等药理作用，受到国际关注。除药用外，栀子黄、栀子蓝均为我国习用的天然食品添加剂[3]，并已应用到日本、美国等国际市场。

目前市售的商品栀子有栀子(又称山栀子；黄栀子)与水栀子之分，其中水栀子为栀子的变型大花栀子(Gardeniajasminoidesvar.radicans)或长果桅子(Gardeniajasminoidesf.longicarpa)，该品种树形高大，结果率高，果实长而大，因而栽培较广泛。传统习惯认为入药用山栀子，入染料用水栀子[4]。随着水栀子栽培面积的扩大和应用，其与栀子相比较的化学成分[5-7]、药理作用[8]研究受到关注，但二者之间成分异同、功效是否相似尚不明确[9]。课题组在前期栀子应用基础研究过程中[10-11]，进一步调研发现栀子黄在工业生产中常选用水栀子。鉴于水栀子与栀子的成分定量分析报道少见，笔者参考相关研究，以栀子苷、西红花苷-I为指标成分，采用HPLC双波长法测定其含量，并与栀子进行对比分析，为水栀子的质量分析和后续深入开发应用提供科学参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱系统(包括1260 Infinity VL 型四元泵，1260 DAD VL 检测器，美国Agilent 公司)；ODS色谱柱(5C18- PAQ，4.6×250 mm，日本Cosmosil公司)；MP2002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；ME215S电子天平(德国Starorious公司)；SB-5200DTDN超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料 水栀子鲜果(GR161001，4℃冰箱冷藏，产地四川大竹县)由四川广田嘉禾农业开发公司提供；栀子(GJ160603，产地江西)购自苏州市天灵中药饮片有限公司，经苏州大学药学院陆叶博士鉴定依次为茜草科水栀子Gardeniajasminoidesvar.radicans(Thunb.) Makino、栀子GardeniajasminoidesEllis的果实。水栀子干品，采用水栀子鲜果在80℃烘箱干燥24h获得。西红花苷-I对照品为本实验室自制(按液相相对峰面积计，HPLC纯度为90.6%)[10]；栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院)。乙腈(色谱纯，瑞士Oceanpak公司)；纯净水(杭州娃哈哈公司)；甲醇、冰乙酸等其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品50.16mg、西红花苷-I对照品10.13mg，置同一50mL棕色容量瓶中，用甲醇超声，定容，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，制成系列对照品混标溶液。

2.2 供试品溶液的制备 参照中国药典2015版栀子含测项进行[1]。精密称取样品粉末约0.1g，置25mL容量瓶中，加20mL甲醇超声(功率250 W，频率40kHz)提取30min，放冷至室温后定容，经0.45μm滤膜滤过，即得。

2.3 色谱条件[5-6]色谱柱：Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ 色谱柱(250mm × 4.6mm，i.d. 5μm)；以0.1%乙酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相梯度洗脱(0～4min，20% B；4～40min，20%～90% B)；流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长238nm(栀子苷)、440nm(西红花苷-I)；进样量20μL。在该色谱条件下，对照品及供试品中的各色谱峰分离良好，分离度大于1.5。如图1所示。

2.4 线性关系考察 取对照品混标溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定。以对照品浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。得到栀子苷的线性方程为y=2964.8x+156.35，r=0.9999，线性范围50.16～501.6μg/mL；西红花苷-I的线性方程为y=5659.8x+44.591，r=0.9997，线性范围10.13～101.3 μg/mL。结果表明,各成分在各自浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度考察 精密吸取水栀子供试品溶液20μL，重复进样6次，以峰面积指标计算RSD(n=6)，考察方法的精密度。结果测得成分1和2的RSD分别为1.68%和1.02%，表明仪器的精密度符合分析要求。

2.6 重复性考察 按“2.2”项下方法平行制备6份水栀子供试品溶液，按“2.3”项色谱条件测定2种成分的含量。以含量为指标计算RSD，考察方法的重复性。结果测得成分1和2的含量依次为39.23、9.801mg/g，RSD依次为1.20%、1.13%，表明本法重复性符合分析要求。

2.7 稳定性考察 取水栀子供试品溶液，分别于0、4、8、12、16和24h进样分析，测定2种成分峰面积，以峰面积值为指标计算RSD(n=6)。结果测得成分1和2的RSD依次为3.01%、4.56%，表明本法供试品24h内稳定性良好。

2.8 加样回收实验 精密称取已知含量的水栀子样品50mg，共称取6份，分别加入精密对照品混合溶液(其中含对照品1和2依次为1.962、0.4742mg/mL)1mL，按照2.2项下供试品溶液的制备方法制备。成分1和2的平均回收率分别为97.77%、97.39%，详见表1。

表1 加样回收率实验结果 (n=6)

2.9 样品测定 按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算供试品中2个成分的含量(按干燥品计)。照中国药典2015年版水分测定法第二法，检测供试品中水分含量。结果见表2。

表2 样品测定结果 (n=3)

3 讨论

栀子果实中富含栀子苷、西红花苷、绿原酸酯、果胶、油脂等多种营养物质，相关成分分析报道较多，但水栀子的含量测定报道少见。本文参考前期研究相关文献[1,10-11]，采用双波长法同时定量分析栀子苷和西红花苷-I含量，方法学研究结果表明该法灵敏度高、简便快捷，可为水栀子的质量分析方法提供参考。

水栀子传统习用为染色用品，其主要有效成分与栀子相似[5-7]，但二者主成分的具体含量差异尚不明确，目前中国药典仅收载栀子为中药材正品[1]。本研究表明，本批次样品中水栀子与栀子的栀子苷含量差异不大，而西红花苷-I含量有较大差异，推测主要与西红花苷热稳定性差、容易降解有关，这与文献报道的栀子炮制过程中西红花苷含量明显降低现象相一致[12-13]。研究结果表明，水栀子的主成分与栀子相似，在栀子药材加工、栀子黄制备过程中应注意防止高温高热引起的西红花苷类成分降解。水栀子的药理作用与栀子是否相似，应在测定主要有效成分(栀子苷；西红花苷)含量基础上进行比较研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015: 248.

[2]于洋，高昊，戴毅，等. 栀子属植物化学成分的研究进展[J].中草药, 2010, 41(1): 148-153.

[3]中国质检出版社.GB2760-2011食品安全国家标准添加剂使用标准[M].北京：中国质检出版社.2011.

[4]谢宗万. 水栀子的品种考证及品质评价刍议[J]. 中药材，1991, 14(7): 45-47.

[5]刘素娟，张现涛，王文明，等. 水栀子化学成分的研究[J]. 中草药, 2012, 43(2): 238-241.

[6]覃芳敏，孟令杰，袁红娥，等. 水栀子化学成分的研究[J]. 中国药学杂志, 2014, 49(4): 275-278.

[7]侯志飞, 王刚, 孙国祥. 水栀子与栀子高效液相色谱指纹图谱比较研究[J]. 时珍国医国药, 2010, 21(11): 2943-2945.

[8]付小梅，葛菲，褚小兰，等. 栀子和水栀子利胆抗炎作用的对比研究[J]. 江西中医学院学报, 2001, 13(4): 165-166.

[9]刘知远，吴安. 浅析栀子与水栀子的异同点[J]. 海峡药学，2012, 24(9): 31-33.

[10]刘慧璐，冯建勇，王增尚，等. 高色价栀子黄的精制工艺研究[J].中国现代应用药学，2013, 30(12): 1315-1319.

[11]Jianyong Feng, Xihui He, Sheng Zhou, et al. Preparative separation of crocins and geniposide simultaneously from gardenia fruits using macroporous resin and reversed-phase chromatography[J]. Journal of Separation Science, 2014, 37(3): 314-322.

[12]杜伟锋，梁小娟，吴晶宇，等. 栀子炮制前后绿原酸、栀子苷和西红花苷-Ⅰ的比较[J]. 中草药, 2011, 42(10): 2008-2010.

[13]孙娜，徐钢，赵远，等. HPLC测定栀子不同炮制品中栀子苷、绿原酸和西红花苷-Ⅰ含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2014, 20(19): 50-53.

Simultaneous Determination of Geniposide and Crocin-Ⅰ in the Fruits of Gardenia jasminoides var. radicans by HPLC

ZHAO Jiangping1NIU Xin1,2YANG Qun1LI Shujuan1WEI Fengshuang1HAO Lili1LIU Jiangyun1*

1. College of Pharmaceutical Sciences, SooChow University, Suzhou 215123, China；2. Heze City Food and Drug Inspection and Research Institute, Heze 274000, China

Objective To establish an dual-wavelength HPLC method for the simultaneous determination of two compounds in the fruits ofGardeniajasminoidesvar.radicans. Methods The chromatographic separation was performed on a Cosmosil - 5C18-AR-Ⅱ column (250mm × 4.6mm, 5μm) with a gradient elution of methanol and 0.1% acetic acid solution, at a flow rate of 1.0mL/min, and detected at both 238nm (for geniposide, 1) and 440nm (for crocin-Ⅰ, 2). Results The two compounds were separated with satisfaction, with linearity ranges between 50.16～501.6μg/mL (r=0.9999,1) and 10.13～101.3μg/mL (r=0.9997, 2), and average recovery rates to be 97.77% and 97.39%, respectively. Conclusion The method is accurate and selective, which could be applied for the quality analysis of the fruits ofGardeniagenus.

Gardeniajasminoidesvar.radicans; HPLC; Geniposide;Crocin-Ⅰ

R285

A

1007-8517(2017)20-0035-04

全国药学专业学位研究生优秀教学案例项目(2016工业药学)；苏州大学医学部学生课外科研项目(2016-29)。

赵江平(1986-)，男，汉族，硕士研究生在读，研究方向为天然产物研究与开发。E-mail:178309373@qq.com

刘江云(1972-)，男，汉族，博士研究生，副教授，研究方向为天然产物研究与开发。E-mail:liujiangyun@suda.edu.cn

2017-09-02 编辑：穆丽华)