高效液相色谱法测定金丝桃属两种药用植物中金丝桃苷的含量※

胡蕊艳 王晓桐 李 洁 孟令锴

高效液相色谱法测定金丝桃属两种药用植物中金丝桃苷的含量※

胡蕊艳1王晓桐1李 洁2孟令锴3

目的建立测定两种金丝桃属药用植物乌腺金丝桃、长柱金丝桃中金丝桃苷的高效液相色谱分析方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为ZorbaxSB-C18柱，流动相为甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），流速1.0 ml/min，检测波长 358 nm，柱温 30 ℃。结果金丝桃苷在 0.0062～0.0622 mg范围内，进样量与色谱峰面积呈良好线性关系（r=0.9991）；平均回收率为96.41%，RSD=1.27%。结论该法操作简便、准确、稳定性及重复性好，可用于对长柱金丝桃和乌腺金丝桃中金丝桃苷的含量测定。

长柱金丝桃；乌腺金丝桃；金丝桃苷；高效液相色谱法；含量测定

金丝桃属（Hypericum.L.）植物全世界约有400余种，我国有55种，8亚种。黑龙江省分布的金丝桃属植物有两种，分别为乌腺金丝桃（H.attenuatumChoisy.）和长柱金丝桃（Hypericum.ascyron L.）。近年来，研究表明该属植物的一些种类含有黄酮类、双蒽酮衍生物等化合物，具有抗病毒、抗抑郁的活性[1-2]，其含有的金丝桃素对禽流感病毒（H9亚型）有抑制作用，目前已得到医药界的广泛关注[3]。该属植物含有的黄酮醇、黄烷醇类化合物，尤其金丝桃苷也是该属植物的主要活性成分之一。本实验采用高效液相色谱法（HPLC）对黑龙江省野生金丝桃属长柱金丝桃、乌腺金丝桃药材中金丝桃苷成分进行含量测定并比较分析，为合理开发黑龙江省金丝桃属药用资源提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪（Agilent1100）；超声波清洗器（TCQ-250）；紫外-可见分光光度计（UV7501）；电子天平（BP211D）。

1.2 试药金丝桃苷对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：111521-200305）；乙腈、甲醇为色谱纯，实验用水为自制双蒸水，其余实验试剂为分析纯。乌腺金丝桃、长柱金丝桃采收于2016年4—10月，采收地及采收期见表 1，经牡丹江医学院药学院吴兆华教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 对最大吸收波长的选择取实验用金丝桃苷对照品溶液进行光谱扫描，实验表明对照品溶液在358 nm波长处有最大吸收，分离效果良好，干扰少，因此，选择检测波长为358 nm。

表1 实验样品的采收地及采收期

2.2 流动相的选择试用多种溶剂系统，最终确定以甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70）为流动相时金丝桃苷分离效果好，保留时间适宜。

2.3 色谱条件色谱柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相：甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），流速1.0 ml/min，检测波长为363 nm，柱温：30 ℃。在此条件下，金丝桃苷能与其他成分很好分开，金丝桃苷的保留时间为5.5 min。色谱图见1-3。

图1 对照品高效液相色谱图(1为金丝桃苷)

图2 乌腺金丝桃样品高效液相色谱图(1为金丝桃苷)

图3 长柱金丝桃样品高效液相色谱图(1为金丝桃苷)

2.4 实验药材中金丝桃苷的提取方法选择取乌腺金丝桃花期药材4份，每份约0.5 g。分别采用甲醇、乙醇两种溶剂，采用超声提取法进行试验比较，确定提取方法。结果见表2。

表2 提取方法对比结果

2.5 金丝桃苷的HPLC测定

2.5.1 对照品溶液的制备精密称取金丝桃苷对照品适量，加甲醇溶解于10 ml容量瓶中，制成0.0622 mg/ml的对照品储备液。

2.5.2 标准曲线的绘制精密吸取上述储备液1.0、2.5、5.0、6.0、7.5、10.0 ml于10 ml量瓶中，加甲醇稀释，进样，按2.3项下色谱条件测定，以对照品浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：Y=228 38x+66.812，r=0.9991，表明金丝桃苷在0.0062～0.0622 mg范围内线性关系良好。

2.5.3 方法学考察

2.5.3.1 精密度实验精密吸取对照品储备液10 μl，进样6次，金丝桃苷峰面积RSD=0.54%。结果见表3。

表3 精密度实验结果

2.5.3.2 稳定性实验取对照品溶液（0.0497 mg/ml）10 μl，分别于0、1、2、4、8 h各进样1次，测得金丝桃苷峰面积值RSD=0.94%，表明对照品溶液在8 h内稳定。结果见表4。

2.5.3.3 重现性实验取同时期乌腺金丝桃样品平行5份（0.4970 g、0.4959 g、0.4975 g、0.4911 g、0.4991 g），照样品测定方法测定，结果药材含量分别为0.8491%、0.8457%、0.8501%、0.8910%、0.8540%。RSD=2.18%。结果见表5。

表4 稳定性实验结果

表5 重现性实验结果

2.5.3.4 加样回收率实验精密称取乌腺金丝桃药材（含量已测知），分别精密加入金丝桃苷对照品溶液，按照2.5.4项下样品制备与测定方法，进行平行实验 6组。得到金丝桃苷回收率为 96.41%，RSD=1.27%。结果见表6。

表6 金丝桃苷回收率测定结果

2.5.4 药材含量测定取药材0.5 g，置于量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min后，放冷，稀释至刻度，摇均，过滤，弃去初滤液，取续滤液经微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μl，注入色谱仪，记录峰面积，计算含量。测定结果见表7。

表7 不同产地、不同采收期药材中的金丝桃苷含量(n=6)

3 讨论

本实验样品分别在甲醇、乙醇中分别超声提取30 min、60 min，含量测定结果表明，甲醇超声提取60 min时金丝桃苷含量最高，与其他提取条件下金丝桃苷含量相差不大，金丝桃苷可在30 min内较好地溶解，且发现甲醇为溶剂的供试品溶液峰形较好，重现性高，故实验采用甲醇为提取溶剂，超声30 min提取；黄酮苷类成分在高效液相测定时易拖尾，流动相加入酸时可抑制拖尾[4]。曾选用流动相为甲醇:0.025 mol/L磷酸（70:30）、甲醇:0.025 mol/L磷酸（50:50）、甲醇:0.025 mol/L磷酸（40:60），峰形对称性不好，峰较宽，分离度低，而后经过反复实验发现，加入一定量的乙腈后，有了改善峰形，提高了分离度，最终确定流动相为甲醇:乙腈:0.025 mol/L磷酸（10:20:70），经多次、多批样品的测定，系统具有良好的重现性和稳定性。

在本实验过程中同时进行了长柱金丝桃的实验方法考察，因其方法与乌腺金丝桃一致，故只在文中表述了一种，在此条件下可以提取完全，对其他共存成分无影响。根据文献报道，长柱金丝桃中金丝桃苷含量最高的时期为花期[5]，因而选取花期为特征性指标进行含量测定。

4 结论

通过对不同采收地的长柱金丝桃、乌腺金丝桃样品中金丝桃苷的含量测定结果表明：伊春地区乌腺金丝桃样品中金丝桃苷的含量高于牡丹江地区、高于佳木斯地区。伊春地区长柱金丝桃样品中金丝桃苷的含量高于佳木斯地区。由此可以初步推断，野生金丝桃属植物生长环境的不同，其金丝桃苷的含量存在一定的差异。因此，在人工栽培金丝桃属植物时应考虑其生长环境如温度、土壤等因素，选择适合的栽培区域。同时，通过对不同采收时期的乌腺金丝桃样品中金丝桃苷含量测定，表明花期乌腺金丝桃样品中金丝桃苷的含量高于花前期、高于果期、高于幼苗期，由此可以建议乌腺金丝桃的最佳采收期为花期。

[1] 宋馨,祝建,吕洪飞.金丝桃属植物研究进展[J].西北植物学报,2005,25(4):844-849.

[2] Linfang Huang,Shilin Chen.Hypericin in hypericum: chemistry,botanical sources and biological activities[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2012,21(5):388-400.

[3] 韦兰萍,陈建新,何子华,等.金丝桃素体外抗H9N2亚型禽流感病毒活性研究[J].动物医学研究进展,2010,31(12):68-72.

[4] 黄琪,贾鹏晖,肖曦晨,等.HPLC 法分析比较亳州知母须根和主根中芒果苷和知母皂苷B-Ⅱ的含量[J].中医药临床杂志,2016,28(12):1773-1776.

[5] 毛晶磊,王文凯.不同采收期及药用部位的长柱金丝桃中有效成分的含量变化[J].中南药学,2012,10(8):594-597.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.11.008

1牡丹江医学院药学院2013级，黑龙江牡丹江 157011

2牡丹江医学院附属红旗医院血液科，黑龙江牡丹江 157011

3牡丹江医学院天然药物化学与生药学教研室，黑龙江牡丹江 157011

黑龙江省黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（编号：201610229052）；牡丹江医学院大学生科研项目（编号：201641）

作者简历：胡蕊艳（1994-），本科学历。E-mail：1442874067@qq.com

孟令锴（1980-），硕士学位，讲师。主要研究方向为生药鉴定及品质评价。E-mail：mlk720@163.com