小分子抗肿瘤化合物SPH0396在不同种属体内外代谢的比较

摘 要 目的：比较研究SPH0396在不同种属的体内外代谢产物。方法：采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC/Q-TOF MS），比较研究不同种属肝微粒体中SPH0396的体外代谢产物，并进一步研究比格犬和食蟹猴分别灌胃给予SPH0396后血浆中的代谢产物。结果：SPH0396在体内外的代谢产物主要有N-去甲基代谢产物和氮氧化代谢产物。结论：SPH0396在猴的体内外代谢产物与人肝微粒体基本一致，该研究结果可为临床前药代和安全性评价的实验动物选择提供依据。

关键词 代谢产物 SPH0396 肝微粒体 UPLC/Q-TOF MS 不同种属

中图分类号：R961 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）21-0070-06

Comparison of in vitro & in vivo metabolites of an anti-cancer small molecule SPH0396 in different species

XIANG Zhixiong*

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To compare in vitro & in vivo metabolites of SPH0396 in different species. Methods： An ultrahigh performance liquid chromatography/quadruple time-of-flight mass spectrometry （UPLC/Q-TOF MS） method was applied to identify the metabolites in vitro and in plasma after oral administration of 10 mg/kg SPH0396 to beagle dogs and cynomolgus monkeys. Results： The main metabolites of SPH0396 in vitro & in vivo were demethyl metabolites and N-oxidation metabolites. Conclusion： The main metabolites of SPH0396 in cynomolgus monkey are basically consistent with those in human liver microsomes. This result can provide basis for the selection of 1aboratory animals in preclinical evaluation of pharmacokinetics and safety of SPH0396.

KEy WORDS metabolite； SPH0396； liver microsome； UPLC/Q-TOF MS； different species

SPH0396是在我院设计的一系列Bcr-Abl抑制剂[1-7]化合物的基础上优选出的一个化合物，其在分子、细胞和整体动物水平的有效性和安全性方面均接近或优于上市药物Bosutinib[8-10]。在我院开展的一些药代动力学实验中，其在体外微粒体[11]、细胞[12-13]和整體动物[14]性质良好，因此将其作为候选化合物进一步研究。根据CFDA药物非临床药代动力学研究技术指导原则[15]，本研究比较了SPH0396在不同种属的肝微粒体中的代谢产物，并进一步比较了比格犬和食蟹猴分别灌胃给予10 mg/kg的SPH0396后血浆中的代谢产物，以便为临床前药物代谢和安全性评价中的非啮齿类实验动物的选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂

SPH0396（批号270-74-D-6，纯度99.695%，上海医药集团股份有限公司中央研究院合成）；混合人肝微粒体（批号34689）、混合雄性比格犬肝微粒体（批号74773）、混合雄性短尾猴肝微粒体（批号85158MU）、混合雄性SD大鼠肝微粒体（批号21027）和混合雄性CD-1小鼠肝微粒体（批号74759），均购自美国BD Gentest公司；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）（德国罗氏公司）；色谱纯乙酸铵（纯度99%，美国Tedia公司）；色谱纯乙腈（德国Merck公司）；色谱纯甲酸（德国Fluka公司）；超纯水由Millipore公司纯水机制备。比格犬2只，雄性，体重8～12 kg；食蟹猴2只，雄性，体重4～6 kg，分别由北京玛斯生物技术有限公司和苏州西山药物研究有限公司提供。生产许可证号分别为SCXK（京）2011-0003和SCXK（苏）2012-0009。

1.2 仪器

Triple TOF 5600+型四极杆飞行时间串联质谱仪（配有电喷雾电离源（ESI源）和CDS自动校正系统，美国AB Sciex公司）；Acquity UPLC液相色谱系统（配有二元输液泵、自动进样器、柱温箱、脱气机和TUV紫外检测器，美国Waters公司）；恒温孵育器（美国Eppendorf公司）；labnet VX200振荡器（美国labnet公司）；多管振荡器（美国Fisher Scientific公司）；Thermo Heraeus X3R 冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）。

1.3 方法

1.3.1 体外肝微粒体温孵方法和样品的制备endprint

每个孵育体系总体积为100 μl，介质为100 mmol/L磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4），包括终浓度为3 μmol/L的SPH0396和0.5 mg/ml肝微粒体蛋白，采用37 ℃水浴进行孵育，预孵育3 min后，向缓冲液-底物-微粒体蛋白混合物中加入1 mmol/L的NADPH起始反应，反应60 min后加入同体积冰冷乙腈终止反应。所有孵育样本均为双样本。

每一种属肝微粒体孵育液取双样本各60 ml合并，涡流混合1 min，离心5 min（14 000 r/min），全取上清液，转移至1.5 ml EP管中，40 ℃氮气流下吹干，残留物以120 ml乙腈-水（10∶90， v/v）溶解，取10 ml进行UPLC-UV/Q-TOF MS分析。

1.3.2 体内动物实验方法和样品的制备

健康雄性比格犬和食蟹猴各2只，试验前禁食12 h，自由饮水，以10 mg/kg的剂量口服灌胃（给药容积为2 ml/kg），采集给药前（0 h）及给药后2.0、6.0和24 h的血浆。

将猴或犬血浆样品按时间点等体积合并，获得每一种属各时间点（0、2 、6 和24 h）合并血浆样品。取200 ml样品，加入400 ml乙腈，涡流混合1 min，离心5 min（14 000 r/min），全取上清液，转移至1.5 ml EP管中，40 ℃氮气流下吹干，残留物以100 ml乙腈-水（20∶80， v/v）溶解，取7 ml进行UPLC/Q-TOF MS分析。

1.4 样品检测

色谱条件：色谱柱为Acquity TM HSS T3 C 18 柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm），美国Waters公司；流动相为含0.05%甲酸水溶液的5 mmol/L醋酸铵 （A）∶乙腈溶液（B），梯度洗脱：0～1 min，A 95%；1～7 min，A 95%～50%；7～7.5 min，A 50%～1%；7.5～10 min，A 1%；10～10.3 min，A 50%～1%；10.3～15 min，A 95%；柱温为40 ℃；流速为0.45 ml/min；UV检测波长为280 nm。

质谱条件：电喷雾电离源（ESI），正离子扫描（高灵敏度模式）方式检测，GAS1：60 psi，GAS2：60 psi，Current GAS：40 psi，源温度为550 ℃，离子喷雾电压（ISVF）为5 500 V，去簇电压80 eV，一级全扫描时碰撞能量为10 eV，二级全扫描时碰撞能量为30 ± 10 eV，扫描范围为m/z 100～700，采用自动校正系统（CDS）外标法校正质量数。

采用AB Sciex公司的Analyst？ TF V1.6和Waters公司的Masslynx V4.1软件进行数据采集，采用AB Sciex公司的PeakView？ V1.2和MetabolitePilot V1.5軟件进行数据分析。

2 结果

2.1 SPH0396对照品质谱分析

在一级全扫描质谱图中，获得m/z 553.162 7的准分子离子（[M + H]+）及m/z 555.160 4（[M + H + 2]+）和557.159 6（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1，在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 453.062 0、389.089 4和101.108 3。

2.2 体外代谢产物分析

M1：从MDF色谱图中选择性检测m/z 521.182 0，在保留时间5.18 min处检测到1个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 521.180 9的准分子离子（[M+ H]+）及m/z 523.180 2（[M + H + 2]+）的氯同位素离子，二者丰度比约为3∶1，提示分子中含有1个氯原子，根据准确质量信息，推测M1的分子式为C27DH25N5O4Cl，与原形药物相比减少CHCl，增加1个O原子；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 435.096 8和371.123 0，推测M1为原形药物氧化脱氯并N-去甲基代谢产物。

M2：从MDF色谱图中选择性检测m/z 525.131 0，在保留时间6.20 min处检测到1个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 525.131 7的准分子离子（[M + H]+）及m/z 527.129 2（[M + H + 2]+）和529.133 6（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1，根据准确质量信息，推测分子式为C26DH22N5O3Cl2，与原形药物相比减少C2H4；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 439.045 1，较原形药物碎片离子453.062 0减少14，推测M2为原形药物N-去甲基并O-去甲基代谢产物。

M3：从MDF色谱图中选择性检测m/z 535.196 0，在保留时间5.26 min处检测到1个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 535.197 2的准分子离子（[M + H]+）及m/z 537.194 4（[M + H + 2]+）的氯同位素离子，二者丰度比约为3∶1，提示分子中含有1个氯原子，根据准确质量信息，推测M3的分子式为C28DH27N5O4Cl，与原形药物相比减少Cl，增加OH；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 435.096 5和371.123 3，推测M3为原形药物氧化脱氯代谢产物。

M4：从MDF色谱图中选择性检测m/z 537.173 0，在保留时间4.36和4.99 min处检测到2个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 537.174 5的准分子离子（[M + H]+）及m/z 539.173 4（[M + H + 2]+）的氯同位素离子，二者丰度比约为3∶1；产物离子扫描质谱图中主要检测到435.095 6碎片离子；根据准确质量信息，推测M4-1和M4-2的分子式为C27DH25N5O5Cl，与M1相比增加1个O原子，推测M4-1和M4-2为M1哌嗪环单氧化代谢产物。endprint

M5-1：从MDF色谱图中选择性检测m/z 539.146 0，在保留时间6.30处检测到1个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 539.147 8的准分子离子（[M + H]+）及m/z 541.144 6（[M + H + 2]+）和543.142 8（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1，根据准确质量信息，推测分子式为C27DH24N5O3Cl2，与原形药物相比减少CH2；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 439.046 5，较原形药物碎片离子453.062 0减少14，推测M5-1为原形药物O-去甲基代谢产物。

M5-2：从MDF色谱图中选择性检测m/z 539.146 0，在保留时间6.92 min处检测到1个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 539.148 3的准分子离子（[M + H]+）及m/z 541.145 7（[M + H + 2]+）和543.143 2（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 453.062 6，M5-2与N-去甲基代谢产物对照品溶液具有相同的色谱和质谱行为，确定其为SPH0396的N-去甲基代谢产物。

M6：从MDF色谱图中选择性检测m/z 551.189 0，在保留时间4.53和5.44 min处检测到2个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 551.191 2的准分子离子（[M + H]+）及m/z 553.190 6（[M + H + 2]+）的氯同位素离子，二者丰度比约为3∶1，产物离子扫描质谱图中主要检测到435.096 3碎片离子；根据准确质量信息，推测M6-1和M6-2的分子式为C28DH27N5O5Cl，与M3相比增加1个O原子；推测M6-1和M6-2为M3的甲基哌嗪环单氧化代谢产物。

M7-1：从MDF色谱图中选择性检测m/z 555.144 0，在保留时间6.10处检测到1个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 555.144 4的准分子离子（[M + H]+）及m/z 557.139 8（[M + H + 2]+）和559.138 7（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1，根据准确质量信息，推测分子式为C27DH24N5O4Cl2，与M5-2相比增加1个O原子；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 453.061 1与M5-2相同，推测M7-1为M5-2哌嗪环单氧化代谢产物。

M7-2：从MDF色谱图中选择性检测m/z 555.144 0，在保留时间6.45 min处检测到1个色谱峰，在一级全扫描质谱图中，获得m/z 555.140 8的准分子离子（[M + H]+）及m/z 557.140 1（[M + H + 2]+）和559.139 0（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 439.044 8，与M5-1相同，推测M7-2为M5-1甲基哌嗪环单氧化代谢产物。

M8：从MDF色谱图中选择性检测m/z 569.158 0，在保留时间6.33和7.18 min处检测到2个色谱峰，分别命名为M8-1和M8-2，在M8-1的一级全扫描质谱图中，获得m/z 569.157 7的准分子离子（[M + H]+）及m/z 571.155 8（[M + H + 2]+）和573.151 4（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1，根据准确质量信息，推测分子式为C28DH26N5O4Cl2，与原形药物相比增加1个O原子；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 453.061 0，与原形药物相同，推测M8-1为原形药物甲基哌嗪环单氧化代谢产物。在M8-2的一级全扫描质谱图中，获得m/z 569.158 4的准分子离子（[M + H]+）及m/z 571.156 0（[M + H + 2]+）和573.154 5（[M + H + 4]+）的氯同位素离子，三者丰度比约为9∶6∶1；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 453.061 8，M8-2与N-氧化代谢产物对照品溶液具有相同的色谱和质谱行为，确定其为SPH0396的N-氧化代谢产物。

M9： 从MDF色谱图中选择性检测m/z 585.153 0，在保留时间6.19 min处检测到1个色谱峰，一级全扫描质谱图中，获得m/z 585.153 8的准分子离子（[M + H]+）及m/z 587.153 5（[M + H + 2]+）和589.151 1（[M + H + 4]+）的氯同位素離子，三者丰度比约为9∶6∶1，根据准确质量信息，推测分子式为C28DH26N5O5Cl2，与M8-1相比增加1个O原子；在产物离子扫描模式下，获得主要碎片离子为m/z 453.061 0，与M8-1相同，推测M9为原形药物甲基哌嗪环双氧化代谢产物。

2.3 SPH0396在不同种属肝微粒体中的代谢产物

SPH0396在五种属肝微粒体中均不稳定，孵化60 min后，在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中分别有68.9%、84.5%、96.9%、47.4%和58.4%的原形药物发生氧化代谢，代谢过程均为NADPH依赖。推测的SPH0396在各种属肝微粒体中的代谢产物信息见表1和2，代谢途径见图2。

2.4 SPH0396在比格犬和食蟹猴血浆中的代谢产物

利用MetabolitePilot软件对给药后的比格犬和食蟹猴血浆样品数据进行处理，代谢产物命名同肝微粒体代谢种属比较试验。原形药物和代谢物的相关信息见表3，代谢途径见图3。endprint

3 讨论

在人肝微粒体中主要代谢途径为氧化脱氯、甲基哌嗪环N-氧化及N-去甲基。从代谢产物种类和相对含量比较，大鼠、小鼠、猴和人具有相似的代谢物谱。犬肝微粒体中主要代谢途径为甲基哌嗪环N-氧化，与人肝微粒体代谢物谱有较大差异。

给药后的食蟹猴血浆中主要检测到原形药物，检测到少量的N-去甲基代谢产物M5-2、甲基哌嗪环氮氧化代谢产物M8-2以及氧化脱氯代谢产物M3。给药后的比格犬血浆中主要检测到原形药物，检测到的代谢产物有 N-去甲基代谢产物M5-2和甲基哌嗪环氮氧化代谢产物M8-2，与原形药物质谱峰面积比略高于食蟹猴血浆。猴肝微粒体中主要代谢产物氧化脱氯代谢物M3在猴血浆中可检测到，但质谱峰面积小于原形药物的0.5%，在犬血浆中未检测到。

從各种属肝微粒体代谢产物种类和相对含量比较，主要代谢物甲基哌嗪环氮氧化（M8-2）在猴微粒体中情况与人更接近；从体内SPH0396灌胃给药后在比格犬和食蟹猴血浆中的代谢产物看，甲基哌嗪环氮氧化（M8-2）在比格犬血浆中偏多，原型药物在比格犬体内的半衰期比食蟹猴体内的短，原型药物在食蟹猴体内暴露更充分。研究结果表明SPH0396在食蟹猴体内的表现情况更接近于人，所以SPH0396临床前药代和安全性评价的实验动物可以选择食蟹猴作为人代谢性质相近的非啮齿类动物。

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