扇叶铁线蕨总黄酮和总酚含量及其抗氧化能力分析

张 昕, 王梦颖, 李懿宸, 曹建国, 戴锡玲

(上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

扇叶铁线蕨总黄酮和总酚含量及其抗氧化能力分析

张 昕, 王梦颖, 李懿宸, 曹建国, 戴锡玲*

(上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

测定了扇叶铁线蕨(AdiantumflabellulatumL.)的总黄酮和总酚含量及其对DPPH(DPPH˙)自由基、ABTS自由基(ABTS˙)的清除力和Fe的还原力.结果表明:1)扇叶铁线蕨总黄酮质量分数在6%～8%之间,总酚质量分数在7%～14%之间,地下部分总黄酮和总酚含量高于地上部分,不同产地的扇叶铁线蕨总黄酮和总酚含量存在一定差异;2)扇叶铁线蕨提取物具有一定的Fe还原能力,以及清除DPPH自由基和 ABTS自由基的能力;且ABTS自由基清除能力和Fe还原能力随总黄酮和总酚浓度的增加而增强.

扇叶铁线蕨; 总黄酮; 总酚; 抗氧化能力

全世界约有12 000种蕨类植物,多分布于热带、亚热带地区,中国约有2 600种,其中可以入药的有300余种,主要分布在中国南部地区以及西南地区.蕨类植物的化学成分主要包括酚类化合物、黄酮类化合物、生物碱类等[1].按化学结构可将生物黄酮分为4类,即原花青素类、槲皮素类、柑桔生物黄酮类和绿茶多酚类[2-3].黄酮类化合物具有抑制肿瘤细胞糖酵解和生长、线粒体琥珀酸氧化酶活性的功能而起到抗癌、防癌的作用[4],蕨类抗肿瘤作用随黄酮的抗氧化作用提高而略微增强[5].酚类化合物含有酚羟基结构,具有抗氧化及清除自由基的能力[6].

扇叶铁线蕨(AdiantumflabellulatumL.)为铁线蕨科(Adiantaceae)植物,是中国南方一种有名的中药[7].目前,在扇叶铁线蕨中有挥发油成分分析以及凝集素的糖蛋白特性[8]等方面的报道.本文作者对扇叶铁线蕨的总黄酮和总酚含量进行测定,对其抗氧化活性进行分析,为进一步开发利用扇叶铁线蕨的药用价值积累资料.

1 材料与方法

1.1材料

扇叶铁线蕨于2015年10月和2016年2月分别采自广东省梅州市蕉岭和广西宜州市洛西镇祥贝村,曹建国教授鉴定,凭证标本保存在上海师范大学蕨类植物标本室.野外采集生长良好的完整植株.植株经过清洗,整理,放置在阴凉通风处干燥备用.

1.2方法

1.2.1 提 取

将采自广东、广西的扇叶铁线蕨地上和地下部分分别洗净,放在阴凉通风处干燥,随后用粉碎机将其打成粉末状.水浴锅温度设为60 ℃,圆底烧瓶称重.用天平精确称取粉末1 g,放入圆底烧瓶中,加入25 mL 体积分数为60%的乙醇溶液,60 ℃水浴2 h,超声25 min,真空泵抽滤,收集滤液,再在滤渣中加入25 mL体积分数为60%的乙醇溶液,重复上述操作,将两次滤液合并.蒸干滤液,再次称重圆底烧瓶,得提取物干重,计算乙醇提取物的提取率(提取物干重/材料粉末重量).

1.2.2 总黄酮含量测定

1.2.2.1 芦丁标准曲线的制作

芦丁标准液:准确称取芦丁10 mg,用体积分数为95%的乙醇定容至50 mL,摇匀得到质量浓度为20 μg·mL-1的标准液.标准曲线的制作:向5 mL试管中分别准确加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL芦丁标准液,再分别加入纯净水2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL.向每个试管中各加入0.15 mL质量分数为5%的NaNO2溶液,将试管摇匀,放置6 min后,再向每个试管中加入0.15 mL质量分数为5%的Al(NO3)3溶液,摇匀,6 min后,再向每个试管中加入2.2 mL质量分数为4%的NaOH溶液,立即摇匀,放置12 min,测定波长510 nm处的吸光度.绘制关于浓度与吸光度之间关系的标准曲线.

1.2.2.2 总黄酮含量的测定

分别取1 mL样品加入试管再加入4 mL甲醇混合均匀,再分别取1 mL样品加入新试管,再加入1.5 mL水和0.15 mL质量分数为5%的 NaNO2溶液摇匀,静置6 min.加0.15 mL质量分数为5%的Al(NO3)3溶液摇匀静置6 min,加2.2 mL质量分数为4%的NaOH溶液,摇匀,静置12 min.以标准曲线制作时的芦丁空白液为空白,测定510 nm波长处的吸光度.样品中的总黄酮质量分数

(1)

式中X为根据回归方程算出的测样浓度,V为抽提液的体积,稀释倍数a=5,取样克数b=1.

1.2.3 总酚含量测定

1.2.3.1 没食子酸标准曲线的制作

取6只试管,分别加入没食子酸0、0.2、0.6、1、1.4、1.8 mL,再加入甲醇2.0、1.8、1.4、1.0、0.6、0.2 mL混匀,分别取60 μL加入到新的试管中,加1.54 mL水,再加入FC与水的体积比为1/2的FC试剂100 μL,摇匀后静置3 min,加质量分数为20%的Na2CO3溶液30 μL,30 ℃暗处理1 h,测定波长750 nm处的吸光度.

1.2.3.2 总酚含量的测定

取质量浓度为1 mg/mL的样品各1 mL于PE管中,分别加入1 mL甲醇,将样品质量浓度稀释至0.5 mg/mL,再取60 μL样品,加入1.54 mL水和100 μL FC试剂,摇匀静置3 min后加质量分数为20%的Na2CO3溶液30 μL,随后30 ℃黑暗处理1 h,测定波长750 nm处的吸光度.

样品中的总酚质量分数

(2)

式中稀释倍数c=2,取样克数d=1.

1.2.4 DPPH自由基清除能力的测定

取7支PE管,分别加入样品0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,再加入体积分数为50%的乙醇1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、1 mL,再加入DPPH1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、0 mL静置30 min,测定波长510 nm处的吸光值.以初始质量浓度为0.5 mg/mL的抗坏血酸(VC)作为阳性对照.

DPPH自由基清除活性

(3)

式中A01为提取剂溶液的吸光值,A11为样品的吸光值.

1.2.5 ABTS自由基清除能力的测定

ABTS储备液:将78 mg ABTS粉末和13.2 mg过硫酸钾溶于20 mL超净水中,搅拌均匀,4 ℃保存,黑暗处理16 h,溶液稳定后待用.

取6支PE管,分别加入样品20、40、60、80、100、120 μL,水130、110、90、70、50、30 μL,ABTS 3 mL,静置6 min,测定波长734 nm处的吸光值.以初始质量浓度为0.5 mg/mL的VC作为阳性对照.

ABTS清除活性

(4)

式中A02为提取剂溶液的吸光值,A12为样品的吸光值.

1.2.6 铁还原力的测定

分别取5支试管,加入样品100、300、500、700、900 μL,水900、700、500、300、100 μL,pH=6的磷酸缓冲液各2.5 mL,质量分数为1%的K3[Fe(CN)6] 2.5 mL,50 ℃水浴20 min,加入质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)2.5 mL,3 000 r/min 离心10 min.

铁还原力

NFe=A1-A2,

(5)

式中A1、A2分别为2.5 mL上清液+2.5 mL水+0.5 mL Fecl3及2.5 mL上清液+3 mL水在波长700 nm处的吸光值.

1.3数据采集及分析

本实验使用Infinite M200 PRO酶标仪测定吸光值,利用Origin软件计算出标准曲线.实验中每组数据均重复3次,取平均值.

2 结果与分析

2.1扇叶铁线蕨乙醇提取物的提取率

提取率可以用来分析蕨类植物提取物的量与其生物活性是否存在相关关系.提取率指的是样品60%乙醇得到的提取物与材料粉末质量的比值.广东产扇叶铁线蕨的地上部分的提取率为15.2%,地下部分的为14.3%;广西产扇叶铁线蕨的地上部分的为13.9%,地下部分的为15.0%,综上,扇叶铁线蕨不同部分和不同产地乙醇提取物提取率在13.9%～15.2%之间.

2.2扇叶铁线蕨总黄酮含量的分析

扇叶铁线蕨中含有黄酮化合物,其总黄酮质量分数在6%～8%之间.其中,广东产扇叶铁线蕨的地下部分总黄酮质量分数最高,为7.82%,其次是广西产扇叶铁线蕨的地下部分,为7.39%,以及广西产扇叶铁线蕨的地上部分,为7.18%,最少的是广东产扇叶铁线蕨的地上部分为6.60%.总黄酮含量的排序为:扇叶铁线蕨(广东地下部分)>扇叶铁线蕨(广西地下部分)>扇叶铁线蕨(广西地上部分)>扇叶铁线蕨(广东地上部分);综上,不同产地总黄酮含量存在差异,同一产地的地下部分总黄酮含量高于地下部分.

2.3扇叶铁线蕨总酚含量的分析

扇叶铁线蕨中含有酚酸物质,总的质量分数在7%～14%之间.其中,广东产扇叶铁线蕨地下部分最高,为13.2%,其次是广西产扇叶铁线蕨地下部分,为10.6%,以及广西产扇叶铁线蕨地上部分,为9.76%,最少的是广东产扇叶铁线蕨的地上部分,为7.81%.总酚含量的排序为:扇叶铁线蕨(广东地下部分)>扇叶铁线蕨(广西地下部分)>扇叶铁线蕨(广西地上部分)>扇叶铁线蕨(广东地上部分);综上,不同产地、相同部位扇叶铁线蕨的总酚含量有差异,同一产地的不同部位扇叶铁线蕨的总酚含量也不同,地下部分高于地上部分.

2.4扇叶铁线蕨的DPPH自由基清除活性测定

在DPPH自由基清除实验中,DPPH可在有机溶剂中形成一种稳定的自由基,呈紫红色,且具有典型的特征吸收峰;当反应体系中存在抗氧化剂时,抗氧化剂提供氢原子和电子给DPPH自由基,使其生成无色产物,使溶液吸光值变小[9].所测扇叶铁线蕨存在一定的DPPH清除能力(图1).其中,广西的扇叶铁线蕨地下部分的DPPH自由基清除活性最大,高于80%,广东的扇叶铁线蕨地下部分DPPH自由基清除活性最小,低于50%.在DPPH体系中,扇叶铁线蕨清除DPPH自由基的能力依次为:扇叶铁线蕨(广西地下部分)>扇叶铁线蕨(广西地上部分)>扇叶铁线蕨(广东地上部分)>扇叶铁线蕨(广东地下部分).在一定范围内,随着扇叶铁线蕨总黄酮和总酚质量分数的增加,DPPH自由基清除活性逐渐增强.

2.5扇叶铁线蕨的ABTS自由基清除活性测定

在ABTS自由基清除体系中,ABTS自由基经氧化后生成相对稳定的蓝绿色ABTS水溶自由基,抗氧化剂与ABTS自由基反应后使其溶液褪色,特征吸光值降低,溶液褪色越明显表明所检测物质的总抗氧化能力越强[9].

所测扇叶铁线蕨存在一定的ABTS自由基清除活性(图2).在ABTS自由基体系中,广东的扇叶铁线蕨地下部分ABTS自由基清除力最大,广东的扇叶铁线蕨ABTS自由基清除力相对最小.可见,扇叶铁线蕨ABTS自由基清除力分别为:扇叶铁线蕨(广东地下部分)>扇叶铁线蕨(广西地上部分)>扇叶铁线蕨(广西地下部分)>扇叶铁线蕨(广东地上部分),且清除ABTS自由基能力随总黄酮和总酚浓度的增加而增强.

图1 扇叶铁线蕨的DPPH自由基清除活性

图2 扇叶铁线蕨的ABTS自由基清除活性

2.6扇叶铁线蕨的铁还原力测定

铁还原力测定原理为Fe3+可被样品中还原物质还原为Fe2+形式,样品溶液呈现出明显的蓝色,并于波长700 nm处具有最大光吸收,可根据吸光值的大小计算样品抗氧化活性的强弱[9].所测的扇叶铁线蕨都存在一定的铁还原力,铁还原力达到15%时所需样品的量各有不同,其中广西产扇叶铁线蕨的地上部分所需样品的用量最少,为360 μL.因此,在一定范围内随扇叶铁线蕨总黄酮和总酚浓度的增加铁还原力逐渐增大(图3).

图3 扇叶铁线蕨的铁还原力

3 讨 论

3.1蕨类植物总黄酮含量及其影响因素

黄酮类化合物广泛存在于蕨类植物中,不同的蕨类总黄酮含量不同.其中,鳞毛蕨科植物的总黄酮含量较高,同形鳞毛蕨(Dryopterisuniformis)、稀羽鳞毛蕨(D.sparsa)、变异鳞毛蕨(D.varia)、暗鳞鳞毛蕨(D.atrata)、红盖鳞毛蕨(D.erythrosora)、棕鳞耳蕨(Polystichumpolyblepharum)、对马耳蕨(P.tsus-simense)、斜方复叶耳蕨(Arachniodesrhomboidea)、贯众(Cyrtomiumfortunei)、狭顶鳞毛蕨(D.lacera)、半岛鳞毛蕨(D.peninsulae)、戟叶耳蕨(P.tripteron)这12种鳞毛蕨科植物的总黄酮质量分数介于 1.08%～14.86%之间[5,9].本文扇叶铁线蕨的总黄酮质量分数在6.6%～7.82%之间.

研究表明,蕨类不同部位的总黄酮含量不同.红盖鳞毛蕨的总黄酮质量分数在叶、茎和根等部位从2.1%到8.26%不等[10].阔鳞鳞毛蕨(D.championii)、贯众、井栏边草(Pterismultifida)的地下部分总黄酮含量均高于地上部分[1].本文作者采自广东、广西两个产地的扇叶铁线蕨的地下部分均比地上部分总黄酮含量高.不同部位总黄酮含量不同的原因可能有:植物不同部位基因的特异表达转录[11]、植物在生长发育过程中各器官起不同作用,具有不同的生理代谢量,从而使不同部位中代谢物含量存在着明显差异[12].本文作者认为由于不同部位酶活性不同以及组织特异性,使扇叶铁线蕨不同部位总黄酮含量不同,这在广东产扇叶铁线蕨中更明显.

产地对蕨类及其他植物中总黄酮含量具有一定影响.不同产地的银杏叶中黄酮含量存在差异[13].产地对总黄酮含量不同的影响可能与生长环境,如温度、光照、土壤、水质和采收时间以及贮藏加工等因素有关[14].广西、广东两个产地的扇叶铁线蕨的地上部分总黄酮质量分数分别是7.18%、6.60%;地下部分总黄酮质量分数分别是7.39%、7.82%.本文作者认为广西和广东两个产地的气候比较接近,造成总黄酮含量差异的主要原因可能是土壤的差异、植物自身的生长状况以及采摘时间的不同.

3.2蕨类植物总酚含量以及影响因素

阔鳞鳞毛蕨、异鳞鳞毛蕨(D.varia)、黑足鳞毛蕨(D.fuscipes)、刺头复叶耳蕨(A.exilis)和香鳞毛蕨(D.fragrans)5种鳞毛蕨科植物总酚质量分数均较高,在5%～20%之间,但不同部位总酚含量均有所不同[15-16].本研究测得扇叶铁线蕨总酚质量分数为7.8%～13.2%,广东产扇叶铁线蕨的地上和地下部分总酚质量分数分别是7.81%和13.2%,广西产的地上和地下部分总酚质量分数分别是9.76%和10.6%,由此得出不同部位总酚含量不同,具有组织特异性,与前人研究[17]结果一致.推测原因可能与总黄酮含量差异相似,即代谢量不同造成不同部位的总酚积累量不同[18].广西产扇叶铁线蕨地下部分与广东产的地下部分总酚质量分数分别是10.6%和13.2%,产地不同蕨类总酚含量也不同,可能与植物的自身基因表达、生态环境因子以及植物建立的一系列保护机制影响总酚等次级代谢产物含量有关[19].

3.3扇叶铁线蕨总黄酮和总酚与抗氧化活性之间的相关性

植物总黄酮和总酚含量与ABTS、DPPH清除能力及铁还原力之间具有一定的相关性[20].本研究中扇叶铁线蕨总黄酮和总酚含量存在正相关关系;且在一定范围内,随着样品浓度的增加,DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、铁还原力都呈上升趋势,表明总黄酮和总酚含量与其抗氧化活性具有正相关性.但不同的扇叶铁线蕨样品在相同浓度时,其总黄酮以及总酚含量与自由基清除力、还原力不具明显相关关系.可能由于扇叶铁线蕨中除了总黄酮和总酚外,还有其他抗氧化物质存在;此外,黄酮类化合物存在多样性,不同种类、结构黄酮类化合物具有不同的抗氧化功效[21].所以,在各样品间体现不出明显相关关系.

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(责任编辑:顾浩然,包震宇)

TotalflavonoidsandtotalphenolcontentandtheirantioxidantactivitiesoffernAdiantumflabellulatum

Zhang Xin, Wang Mengying, Li Yichen, Cao Jianguo, Dai Xiling*

(Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

The contents of total flavonoids and total phenol of fernAdiantumflabellulatumL. were determined.The DPPH and ABTS free radical scavenging activities and Fe reduction force were determined and analyzed as well.The results showed:1) The total flavonoid content ofA.flabellulatumranged from 6%～8%,while the total phenol contents ranged from 7%～14%.Total flavonoid and total phenol contents in subterranean parts were both higher than those in aerial parts.And total flavonoid and total phenol contents were different for material from different localities;2) The extracts fromA.flabellulatumhave certain ferric reducing ability of plasma and DPPH and ABTS radicals scavenging activities.And ABTS scavenging activity and ferric reducing ability of plasma both strengthen along with the increasing of concentration of total flavonoids and total phenol respectively.

AdiantumflabellulatumL.; total flavonoids; total phenol; antioxidant capacity

R 284

A

1000-5137(2017)05-0684-07

2017-08-25

上海市自然科学基金(15ZR1430500);上海市科学技术委员会课题(14DZ2260400);上海市绿化和市容管理局科学技术项目(G152430);上海植物种质资源工程技术研究中心项目(17DZ2252700)

张 昕(1994-),女,在读本科生.E-mail:zhangxinaurora@126.com

导师简介: 戴锡玲(1973-),女,副教授,主要从事蕨类植物发育生物学方面的研究.E-mail:daixiling2010@shnu.edu.cn

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