超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱筛查水果罐头中37种食品添加剂

王骏，宿书芳，胡梅，徐大玮，祝建华

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南，250101)

超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱筛查水果罐头中37种食品添加剂

王骏*，宿书芳，胡梅，徐大玮，祝建华

(山东省食品药品检验研究院，山东 济南，250101)

建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱筛查水果罐头中37种食品添加剂的方法。试样用乙腈-水提取，以乙腈-乙酸铵溶液为流动相，在Acquity UPLC BEH C18色谱柱上进行分离，电喷雾电离源负离子模式下采用全信息串联质谱信息采集的模式检测，通过各化合物的分子离子和特征碎片离子结合保留时间定性，外标法定量。结果表明，方法定量限为0.02～0.5 mg/kg，在0.5～50 μg/mL内线性关系良好(r≥0.99)，所有添加剂的回收率为79.5%～103.5%。该方法快速、灵敏、准确，适用于罐头中37种食品添加剂的快速筛查。

超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱；食品添加剂；筛查；水果罐头

水果罐头中常用的食品添加剂主要是防腐剂、甜味剂和合成色素。超范围、超限量使用这些食品添加剂可能对消费者健康造成损害。目前食品添加剂的定量检测方法主要有：薄层色谱法[1]、液相色谱法[2-10]、气相色谱-质谱法[11-15]、液相色谱-质谱法[16-20]等，这些方法多针对一种或几种添加剂，还不能实现多种不同类别食品添加剂的同时测定。液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术近年来日趋成熟[21-23]，通过飞行时间质谱测定目标物和其碎片离子的精确质量数，可实现对多种食品添加剂的快速准确筛查。四极杆飞行时间质谱作为一种高分辨技术，能够获得样品的全扫描质谱图，质量测定的精度越高，理论上越可以减少可能的目标化合物数量，从而增强对目标化合物确认的可信度。对于多种食品添加剂的快速筛查分析，这种技术非常有效。本文应用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术，测定了水果罐头中37种食品添加剂，探索了同时使用分子离子、特征碎片离子和保留时间作为定性筛查依据，对多种、多类食品添加剂进行高通量筛查的新方法。

1 实验部分

1.1材料与仪器

1.1.1 试剂

苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝、赤藓红、靛蓝、新红和诱惑红：均购自中国国家标准物质中心；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、纳他霉素、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖、喹啉黄、酸性红52、酸性红92、酸性黄17、橙黄Ⅱ、偶氮玉红、酸性红13、丽春红3R、萘酚黄、食用绿色2号、孟加拉红、酸性红14、专利蓝、亮黑，均购自德国Dr.公司，纯度83%～99%。乙腈(色谱纯，Fisher公司，美国)，乙酸铵(纯度gt;99%，Sigma公司，美国)，实验用水为超纯水机(Millipore公司，美国)现制备。0.22μm有机相微孔滤膜。

1.1.2 仪器

AcquityRUPLCR型超高效液相色谱仪，由二元泵、柱温箱、自动进样器组成，美国Waters公司。XEVO QTOF型四极杆飞行时间质谱仪，配电喷雾电离源(ESI)，带有Masslynx 4.1及Chromlynx和Targelynx软件，美国Waters公司。

1.2样品处理

水果罐头充分粉碎、混匀后，称取5 g于25 mL比色管中，加超纯水15 mL，置于60 ℃水浴中加热5 min，振摇使样品充分分散、混匀。用氨水(1+1)溶液调至中性，剧烈振摇，40 ℃超声15 min，取出冷至室温后用乙腈定容并摇匀，经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待测。

1.3色谱质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为AcquityRUPLCRBEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters公司)，流动相A为乙腈，流动相B为10 mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序为0～2 min，由2%A线性增加至10%A；2～7 min线性增加至40%A，7～8 min线性增至90%A，8.1 min变为2%A，流速为0.4 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为10 μL。

1.3.2 质谱调谐参数及筛查方法

电喷雾电离负离子模式，毛细管电压2.5 kV，锥孔电压40 V，提取锥孔电压4 V；源温120 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，脱溶剂气流量800 L/h，锥孔气流量50 L/h。采用MSE方式进行数据采集，低能通道的碰撞能量为12 eV，高能通道碰撞能量为15～30 eV，质量扫描范围50～1 000。使用亮氨酸脑啡汰作为质量锁定(Lockmass)的化合物，在负离子模式下，Lockmass的理论参考值为554.261 5。质谱采集过程中，每隔30 s采集一次Lockmass，取每2次采集的Lockmass测定平均值，用于校正此段时间内采集的质荷比的精度，确保所有筛查数据的质量偏差在3×10-6以内。

2 结果与讨论

2.1分析前样品的处理

因为筛查的对象涉及多种食品添加剂，前处理必须兼顾绝大多数组分的提取效率。考虑到大多数添加剂均为钠盐或钾盐，具有较好的水溶性，因此采取了直接用水提取的方法。考虑到某些罐头中可能使用增稠剂，样品不易分散，另外某些添加剂(如山梨酸)在低pH值条件下提取效率欠佳，采取了调节pH值至中性并加热提取的方法，试验证明提取效果较佳，另外为了少引入其他组分，采用氨水调节样品的pH值，而没有使用NaOH。对于对羟基苯甲酸酯类，由于其在中性状态下水溶性不是很好，采取在提取液中加入乙腈的方法，以提高其提取效率；由于乙腈的加入，还可明显减少某些干扰物如蛋白质等对测定的影响。通过基质加标试验，证明前处理方法可满足筛查的要求。

2.2液相色谱条件的优化

由于筛查的组分多达37种，快速、高效的分离尤为重要。本实验选用了Waters公司的AcquityRUPLCRBEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)做为分析柱，以乙腈和10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，进行梯度洗脱，结果表明绝大多数添加剂分离良好，全部组分在8 min内出峰，包括系统平衡在内，仅需10 min即可完成一个样品的筛查。

2.3质谱参数的优化

将各添加剂标样溶液注入质谱仪，对质谱参数进行优化，以获得最佳的灵敏度和足够的子离子信息，优化的结果见1.3.2。锥孔电压和碰撞能量是质谱参数中最重要的2个。锥孔电压直接影响各组分的灵敏度，随着锥孔电压的升高，各添加剂响应值逐渐增强，但锥孔电压过高可能导致色素分子离子在离子源内发生碰撞解离，反而影响母离子的灵敏度。经实验，在锥孔电压25～30 V、碰撞能量为12 eV时，绝大部分添加剂可获得较强的准分子离子峰。为得到各组分的碎片离子，增强本筛查方法的可靠性，同时又不希望损失其准分子离子的灵敏度，采用了MSE的采集模式，即同时采集2个不同碰撞能量通道的数据，低能通道监测准分子离子，高能通道采集碎片离子的信息。低能通道碰撞能量为12eV，高能通道碰撞能量为15～40 eV。

2.4质量测定准确度

表1列出了37种食品添加剂的元素组成、理论质量和测定值以及测定质量偏差，相对质量偏差均小于3×10-6，其中28种添加剂测定的相对质量偏差小于2×10-6。结果表明应用本方法测定水果罐头中的食品添加剂能够获得较高的质量精度。

表1 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测得的水果罐头中添加37种食品添加剂的精确质量和相关数据

续表1

续表1

图1为各食品添加剂添加量为5 mg/kg样品的总离子流图；图2为在0.02 u的质量窗口内提取的37种食品添加剂准分子离子流图。提高质量测定的准确度有利于提高筛查的可靠性。以某次测定中专利蓝的提取色谱图为例，在0.7u的质量窗口内提取专利蓝的色谱图见图3；在0.02 u的质量窗口内提取的专利蓝的色谱图见图4。对照这2张提取离子色谱图，发现在0.7u质量窗口内提取的色谱图中，专利蓝前面有一个小峰，而0.02 u的质量窗口内该峰几乎消失，查看该峰的全扫描质谱图，可见其质量数为557.142 9，其中一个同位素峰为559.144 0，而专利蓝的质量数为559.158 9，当提取质量窗口为0.02 u时，该峰不能被提取(图4)，不会造成干扰；而在低分辨质谱的测定条件下，即与专利蓝同时被提取(图3)。由此可见，如果质量测定的准确度不足，很容易出现假阳性的筛查结果。同时，测定了目标物的准确质量，更容易获得清晰、高信噪比色谱图，也有利于结果的定量和降低检出限。在进行未知物筛查时，测定了分子离子的精确质量，即可通过元素组成解析软件所设定的质量偏差和元素组成的种类、数量，推测可能的分子式组成，分子离子测定的质量偏差越小，可能的分子式数量越少，更容易得到准确的筛查结果。

图1 37种食品添加剂测定的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 37 food addtives

图2 在0.02 u质量窗口提取的37种食品添加剂准分子离子流图Fig.2 Extracted ion chromatogram of 37 food addtives

图3 0.7 u质量窗口内提取的专利蓝色谱图Fig.3 Extracted ion chromatogram for patent blue V in Mass window of 0.7 u

图4 0.02 u质量窗口内提取的专利蓝色谱图Fig.4 Extracted ion chromatogram for patent blue V in Mass window of 0.02 u

A-专利蓝的全扫描质谱图；B-杂质的全扫描质谱图图5 专利蓝及其杂质的全扫描质谱图Fig.5 Full scan mass spectra of patent blue V and its impurities

2.5对检出目标化合物的确证

表1所列添加剂中，很多在某些国家和地区不得在水果罐头中使用，因此对筛查结果的确证尤为重要。根据欧盟指令2002/657/EC[24]的规定，使用高分辨串联质谱获得的一个母离子为2分，一个子离子为2.5分，对禁用物质的定性要求为4分。本方法测定35种食品添加剂，每组分均采集一个母离子、1～2个子离子，完全可满足目标化合物定性确证的要求。图6列出了合成色素新红的高能通道显示的质谱图和母离子、子离子的提取色谱图。

图6 新红色素的二级质谱图Fig.6 Tandem mass spectra of New Red

A、B-两个片的提取色谱图；C-母离子的提取色谱图图7 新红色素母离子和2个碎片离子的提取色谱图Fig.7 Extracted ion chromatogram of mew red and its fragment ion

有些色素的分子式相同，比如苋菜红和胭脂红，母离子都为536.973 2，但苋菜红的主要碎片离子为316.964 4(图8)，而胭脂红为508.968 0和429.010 3(图9)。另外，苋菜红保留时间为1.33 min，胭脂红为2.79 min，二者很容易区分，不会导致误判。因此，本方法可提供充足的包括保留时间、化合物母离子、子离子等定性信息，用于确证筛查出的目标物，筛查和确证可以同时进行。

图8 苋菜红二级质谱图Fig.8 Tandem mass spectra of amaranth

图9 胭脂红二级质谱图Fig.9 Tandem mass spectra of ponceau 4R

2.6线性范围、回收率和检出限

在确定的实验条件下，用40%乙腈溶液配制系列不同浓度(0.5～50 μg /mL)的混合食品添加剂标准溶液进行测定，以各组分的峰面积(y)对其浓度(x, μg /mL) 绘制标准曲线，除喹啉黄、酸性红92、孟加拉红等组分以外，其余添加剂相关系数(r)均优于0.99,表明各种添加剂在0.5～50 μg/mL内具有较好的线性关系，结果见表2。这一工作曲线是根据水果罐头中各食品添加剂的可能用量确定的，虽然本方法对于大部分添加剂具有更低的检出限，但实际使用时含量太低不能起到应有的作用，考虑到本方法是筛查方法而非定量方法，故没有对每种添加剂单独配置工作曲线。

在空白水果罐头中添加不同水平的添加剂混合标准溶液，按照1.2的步骤进行处理，每个添加水平平行测定5次，得到各添加剂的回收率、相对标准偏差(RSD)、方法的最低定量限(LOD) (S/Ngt;10)，具体结果见表2。

表2 37种食品添加剂的线性范围、回收率和检出限

续表2

2.7方法的应用

应用本方法测定了葡萄罐头、桃罐头、橘子罐头等样品30余批，在部分样品中检出糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜等添加剂。筛查结果与相应食品添加剂的定量方法测得值比较，部分吻合较好，部分存在差异。这可能是由于本方法采用了电喷雾电离源，样品间存在程度不同的基质效应。考虑到本方法的主要特点是快速定性和高通量筛查，测定时没有采用空白基质提取液来稀释标样，因而在某些样品基质的定量方面与标准方法有一定的差距。

3 结论

研究结果表明，超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱是对水果罐头中多种食品添加剂进行快速筛查的有效技术，具有分离效率高、定性确证准确并能定量的特点，可用于多种食品添加剂的筛查。同时由于四极杆/飞行时间质谱是以全扫描的方式采集数据，记录了筛查样品中一定质量数范围内的全部信息，而不仅是本方法所研究的37种食品添加剂，因此可以很方便地对以往的筛查数据进行再次分析，从而找出关注的其他目标物。正是由于具有这些特点，超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱快速筛查多种食品添加剂的方法具有广阔的应用前景。

[1] 肖学成.薄层色谱法同时测定食品中4种添加剂的方法介绍[J]. 实用预防医学,1998,5(2)：60-61.

[2] 刘胜男，张国庆,王素方，等.高效液相色谱法同时测定果蔬汁饮料中20种禁限用食品添加剂[J]. 轻工学报，2016,31(4)：23-29.

[3] 丁梅，辛若竹，卜丽伟.可变波长液相色谱法同时测定食品中18种常用食品添加剂研究[J]. 粮食与油脂，2014,27(6)：50-55.

[4] 林海丹，邹志飞，秦燕，等.高效液相色谱法同时测定食品中18种食品添加剂[J].食品科学，2013,34(8)：228-231.

[5] 马康，蒋孝雄，赵敏，等.高效液相色谱法同时测定软饮料中20种食品添加剂[J].分析化学，2012,40(11)：1 661-1 667.

[6] 黄永辉，余清，林钦，等.超高效液相色谱法同时测定碳酸饮料中的22种食品添加剂[J].分析测试学报，2011,30(8)：877-882.

[7] 刘英，尹州，邹晓筱，等.高效液相色谱法同时测定蜜饯中的16种食品添加剂[J].分析测试学报，2011,30(6)：651-655.

[8] 李颖.高效液相色谱法测定调味品和饮料中常见17种食品添加剂[J].中国卫生检验杂志，2010,20(11)：2 738-2 740.

[9] 王骏，胡梅，张卉，等.超高效液相色谱快速测定饮料中的16种食品添加剂[J]. 食品科学，2010,31(2)：195-198.

[10] 李秀琴，张庆合，杨总.高效液相色谱法同时测定肉制品中的6种食品添加剂[J]. 色谱，2010,28(12)：1 204-1 208.

[11] 李春娟,鞠福龙,李东刚. GC-MS法同时检测葡萄酒中10种防腐剂和抗氧化剂[J]. 中国酿造，2009,28(6)：149-152.

[12] 湛嘉，俞雪钧，黄伟，等.复杂基质食品中7种添加剂的气相色谱/质谱检测方法[J]. 分析科学学报，2008,24(6)：729-731.

[13] 曹淑瑞，徐芬，张雷，等.凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱法同时测定食品中3种抗氧化剂[J]. 食品科学，2013,34(12)：160-164.

[14] 寇立娟，梁春实，臧金海.中性氧化铝柱净化-气相色谱/质谱法测定食品中富马酸二甲酯的含量[J]. 食品与发酵工业，2009,35(12)：134-136.

[15] 李东刚，李春娟，刘敬东.GC-MS-SIM检测糕点中的防腐剂和抗氧化剂[J]. 分析仪器，2009,40(4)：56-60.

[16] 王震，石丽珠.超高效液相色谱-串联质谱测定饮料和酒中防腐剂与甜味剂[J]. 食品安全质量检测学报，2014,5(4)：1 179-1 184.

[17] 于洋，卢静.离子色谱和液相色谱串联质谱法测定食品中的添加剂[J]. 化工管理，2015,28(14)：66.

[18] 李晶，徐济仓，缪明明，等.固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱同时检测饮料中13种禁限用食品添加剂[J]. 分析科学学报，2013,29(4)：488-492.

[19] 曹娅，孙利，凌云，等.液相色谱-串联质谱测定食用植物油和调味油中27种添加剂(物)[J].食品科学，2013,34(4)：129-134.

[20] 冯峰，杨烁，凌云，等.超高效液相色谱-串联质谱快速筛查葡萄酒中的14种禁用食品添加剂[J].分析化学，2011,39(11)：1 732-1 737.

[21] 赵冰，沈学静.飞行时间质谱分析技术的发展[J]. 现代科学仪器，2006,23(4)：30-33.

[22] 吴炜亮，李晓明，朱文亮，等.飞行时间质谱技术及其在食品安全检测中的应用[J]. 食品与机械，2015,31(3)：236-241.

[23] 钱疆，杨方，陈弛，等.超高效液相色谱飞行时间质谱测定食品中36种合成色素[J]. 食品科学，2013,34(6)：215-218.

[24] Commission Decision Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results Text with EEA Relevance; Notified under Document Number C(2002)3044).

Screeningmethodof37foodadditivesinfruitcansbyUPLC-Q/TOF

WANG Jun*, SU Shu-fang, HU Mei, XU Da-wei, ZHU Jian-hua

(Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China)

A screening method of 37 food additives in fruit cans was developed by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight-mass spectrometry. The samples were extracted with acetonitrile-water, and separated on an Acquity UPLC BEH C18column using ammonium acetate solution -acetonitrile as the mobile phase and measured by UPLC/Q/TOF mass with electrospray ioninzation in negative mode. The qualitative analyses were based on the characteristic fragment ions of every compounds. The quantitation limitation were 0.02-0.5 mg/kg; the linear relationship was good in the concentration range of 0.5-50 μg/mL, the recoveries were 79.5%-103.5%. The method is simple, sensitive, accurate and suitable for screening food additives in fruit cans．

UPLC-Q/TOF;food additives;Screening method;fruit cans

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014063

学士，研究员(本文通讯作者，E-mail:13953105081@163.com)。

山东省重点研发计划项目(2015GSF120018)

2017-02-16，改回日期：2017-05-17