正交试验法优选肝肾滋总多糖提取工艺

郑 敏

（内蒙古自治区人民医院，内蒙古 呼和浩特 010010）

正交试验法优选肝肾滋总多糖提取工艺

郑 敏

（内蒙古自治区人民医院，内蒙古 呼和浩特 010010）

目的 优选肝肾滋总多糖的最佳提取工艺。方法 以总多糖含量为评价指标，采用正交试验法优选肝肾滋总多糖的最佳提取工艺。结果 肝肾滋总多糖的最佳工艺条件为，浸泡1h，加10倍量水，回流2h，提取2次。结论 该提取工艺简便、稳定，可用于肝肾滋总多糖的提取。

肝肾滋；总多糖；提取工艺；正交设计

肝肾滋收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）》[1]，是由枸杞子、黄芪、党参、麦冬和阿胶制成的煎膏剂，具有益肝明目、滋阴补肾的功效，主要用于肾阴不足、气血两亏、目眩昏暗、心烦失眠、肢倦乏力、腰腿酸软等症。由于该制剂规范年代已久，制剂工艺参数不明确，为保证制剂质量，本研究中根据方中枸杞子、黄芪、党参、麦冬均含有多糖的化学成分及理化性质，结合处方的功能主治，以总多糖含量为指标综合评价，采用水煎煮法，以及 L9（34）正交试验法对影响肝肾滋提取工艺的主要因素进行优选。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV－2450型可见分光光度计（日本岛津公司）；AL204型十万分之一电子天平（梅特勒－托利多仪器＜上海＞有限公司）；RE－52A型旋转蒸发仪（上海振捷实验设备有限公司）；DF－101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 试药

枸杞子（批号为20161109）为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，黄芪（批号为20161019）为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.Var.mongholicus（Bge.） Hsiao 或膜荚黄芪 Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，党参（批号为20161120）为桔梗科植物党参 Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花 党参 Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川党参 Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，麦冬（批号为 20161109）为百合科植物麦冬 Ophiopogon japonicus（L.f）Ker－ Gawl.的干燥块根，均购自安国义通中药材有限公司，经我院中药鉴定室刘斌高级工程师鉴定，均符合2015年版《中国药典(一部)》相关规定。D－葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号为 110625－200911，纯度为98%）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总多糖含量测定方法的建立

2.1.1对照品溶液制备

称取105℃干燥至恒重的 D－葡萄糖对照品21.00 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL中含 D－葡萄糖0.21mg）。

2.1.2测定波长选择

取对照品溶液，在450～550 nm波长范围内进行光谱扫描。结果在489 nm波长处有最大吸收（图1），故含量测定选择489 nm作为测定波长。

图1 溶液紫外吸收光谱图

2.1.3方法学考察

标准曲线绘制：精密量取对照品溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分别置 10 mL 具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0 mL，摇匀，冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10 min，取出，然后立即置冰水浴中冷却10 min，取出，以相应试剂为空白对照溶液。照紫外－可见分光光度法[《中国药典(二部)》附录ⅤA]，在489 nm波长处测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程为 Y＝2.602 42 X－0.312 38，R2＝0.998 9(n＝6）。结果表明，D －葡萄糖对照品溶液质量浓度在0.021～1.26 g／L范围内与吸光度线性关系良好。

重复性试验：吸取同一批样品，依法制备供试品溶液并测定含量。结果总多糖吸光度的 RSD为1.12%（n＝6），表明方法重复性良好。

白煞离开聚贤厅去厢房告诉独自盘坐调息的黑煞萧飞羽所言。黑煞也怔忡起来，好一会他就像踏上了一条不知归期的旅途彷徨喃喃：“我犯了一个无法饶恕的错误，因为我竟然没有想到武功堡残余因为毁家灭门之恨，无论走还是留都会非常努力拖安和庄下水。”

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于显色后0，30，60，90，120，180 min 时依法测定吸光度。结果的RSD为1.89%（n＝6），表明供试品溶液在显色180 min内稳定。

精密度试验：取同一 D－葡萄糖对照品溶液0.5 mL，依法测定吸光度，平行操作 6次。结果的 RSD为1.15%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：取样品提取液0.25 mL，共6份，分别加入 D－葡萄糖对照品溶液0.5 mL，用蒸馏水定容至 2 mL（其中对照品的理论量应为 105 μg），依法测定吸光度，计算含量及回收率。结果见表1。

表1 多糖加样回收试验结果（n＝6）

2.1.4样品制备与含量测定

按处方比例，精密称定粉碎（过3号筛）的枸杞子16 g，黄芪 0.4 g，党参 2 g，麦冬 1 g，各取 9 份，置圆底烧瓶中，加80%乙醇回流，将各提取液过滤，精密量取续滤液5 mL置50 mL离心管中，加20 mL无水乙醇，混匀，离心10 min，将上层乙醇液弃去，用少量无水乙醇清洗离心管，并弃去乙醇液，待离心管晾干后，加入少量热蒸馏水，将多糖全部化开，置50 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，精密量取其液5 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2mL，置10 mL具塞干燥试管中，自“加蒸馏水至2.0 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含D－葡萄糖的质量（mg），计算含量，即得。

2.2 正交试验优化

2.2.1因素水平确定

选取浸泡时间（因素 A）、加水量（因素 B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）作为考察因素，采用L9（34）正交表进行正交试验。因素水平表见表2。

表2 因素水平表

对试验结果进行统计学处理及方差分析，结果表明，各因素之间均无显著性差异。各因素对提取工艺的影响规律为 C＞D＞A＞B，加水量对提取多糖量影响最明显。因此提取多糖的最佳条件为A2B3C3D2，即浸泡1 h，加10倍量水，回流2 h，提取2次。详见表3和表4。

表3 正交试验设计与结果

表4 方差分析结果

2.2.3验证试验

以正交试验得到的最佳工艺条件提取3次，结果总多糖的提取率分别为49.1%，45.6%和44.9%，多糖平均得率为46.5% 。结果与预测一致，表明正交试验得到的最佳提取条件重复性好。

3 讨论

本研究结果显示，各因素对提取工艺的影响强度依次为C＞D＞A＞B，加水量对提取多糖量影响最明显。通过直观分析方法，筛选出提取多糖的最佳工艺条件为 A2B3C3D2，即浸泡 1 h，加 10倍量水，回流 2 h，提取2次。该提取工艺稳定，提取率高。

现代医学研究表明，肝肾滋产品良好的功效主要来源于各味药材的多糖成分，如黄芪多糖具有增强机体抵抗力、促进抗体生成、促进免疫、双向调节血糖和保护心血管系统等作用[2－3]。枸杞多糖主要用于增强免疫、延缓衰老[4]、降低血糖[5－6]、促进核酸和蛋白质合成[7]，并具有抗肿瘤[8]、治疗心血管疾病等作用。党参多糖是党参主要的有效成分之一，研究表明，党参多糖具有抗肿瘤[9]、提高免疫力[10]、抗氧化和抗衰老作用[11]，具有重要的开发价值。麦冬多糖也同样具有多方面的活性，如对心血管系统、呼吸系统、免疫调节、降血糖、抗肿瘤、变态反应、非过敏性哮喘、抗辐射、抗疲劳等方面的作用[12]。

本试验中通过正交设计对肝肾滋中总多糖提取工艺进行优化，并采用紫外分光光度法对优化工艺中的总多糖量进行检测，为肝肾滋多糖新剂型的研制提供了科学依据，为后期多糖产品开发奠定了基础。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）[M].北京：人民卫生出版社，1998：115 －116.

[2]蔡 莉，朱 江.黄芪多糖研究现状与进展[J].中国肿瘤临床，2007，34（15）：896 － 900.

[3]艾连中，吴 艳，郭本恒，等.黄芪多糖的研究进展[J].山东食品发酵，2008（1）：39 －41.

[4]董淑楠，朱柯蕙，印 虹，等.枸杞多糖的理化性质及其免疫调节研究进展[J].中国医药生物技术，2013，8（1）：66 －68.

[5]谭淑敏.枸杞降血糖作用的药效学研究[J].南方医科大学学报，2008，28（11）：2103 － 2104.

[6]丁 园.枸杞多糖对2型糖尿病大鼠血糖、血脂的影响[J].辽宁医学院学报，2015，36（5）：12 － 14.

[7]李晓冰，陈玉龙，展俊平，等.枸杞多糖对糖尿病大鼠血糖水平及机体免疫功能的影响[J].中国全科医学，2013，16（27）：3028－3210.

[8]李卓能，张 靖，周敦金，等.枸杞多糖对人前列腺癌DU－145细胞株体外抗肿瘤作用[J].公共卫生与预防医学，2013， 24（5）：3 － 6.

[9]杨 瑾，刘杰书，袁德培.党参多糖体内抗肿瘤活性实验研究[J].中国处方药，2014，12（3）：25 － 26.

[10]晏永新，张 丽，贾海芳，等.党参多糖口服液对小鼠免疫功能的影响[J].中国兽药杂志，2013，47（3）：18 －20.

[11]郭晓农，戚欢阳，王 兵，等.党参多糖对衰老模型小鼠的抗衰老作用[J].中国老年学杂志，2013，33（21）：5371 －5372.

[12]曹 爽，付绍智，王永多，等.麦冬多糖药理作用研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（28）：63 －66.

Optimization of Extraction Process of Total Polysaccharides from Ganshenzi by Orthogonal Test

Zheng Min
（ Inner Mongolia People′s Hospital， Hohhot， Inner Mongolia， China 010010）

Objective To optimize extraction processof totalpolysaccharidesfrom Ganshenzi.M ethods With the content of total polysaccharide as the evaluation index，the optimum extraction process of total polysaccharides from Ganshenzi was optimized by orthogonal test.Results The optimum process conditions of total polysaccharide of Ganshenzi were soaking 1 h，adding water 10 times，refluxing 2 h，extracting 2 times.Conclusion The extraction process is simple and stable，which can be used for the extraction of total polysaccharides from Ganshenzi.

Ganshenzi；total polysaccharides；extraction process；orthogonal design

TQ460.6；R284.1

A

1006－4931(2017)22－0018－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.22.006

郑敏，女，大学本科，副主任药师，研究方向为医院药学，（电子信箱）454962527＠qq.com。

2017－06－06)