鸢尾甲黄素A对脂多糖诱导小鼠RAW264.7细胞分泌炎性因子的调节作用

邹桂欣 ，孙小玲 ，王光函 ，尤献民，李国信

（1.辽宁省中医研究院，辽宁 沈阳 110034； 2.辽宁省药品检验检测院，辽宁 沈阳 110023）

鸢尾甲黄素A对脂多糖诱导小鼠RAW264.7细胞分泌炎性因子的调节作用

邹桂欣1，孙小玲2，王光函1，尤献民1，李国信1

（1.辽宁省中医研究院，辽宁 沈阳 110034； 2.辽宁省药品检验检测院，辽宁 沈阳 110023）

目的 研究射干中鸢尾甲黄素A对脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子一氧化氮（NO）和白细胞介素6（IL－6）的调节作用。方法 采用LPS诱导RAW264.7细胞，建立细胞炎性反应模型。用不同质量浓度的鸢尾甲黄素A进行干预，并设立空白对照组。通过噻唑蓝(MTT)法测定不同质量浓度鸢尾甲黄素A对RAW264.7细胞活力的影响，Griess法检测NO生成量，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中炎性因子IL－6的含量。结果 鸢尾甲黄素A能明显抑制LPS诱导RAW264.7细胞生成NO和IL－6，且作用强度呈浓度依赖性。结论 鸢尾甲黄素A的抗炎作用可能与减少炎性因子NO和IL－6的生成有关。

鸢尾甲黄素A；脂多糖；RAW264.7细胞；一氧化氮；白细胞介素6；小鼠

射干是鸢尾科植物射干 Belamcandachinensis（L）.DC.干燥根状茎，主含异黄酮类化合物[1]，包括射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素[2－3]、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A等成分[4]，具有明显的抗炎作用[5]。通过网络药理学软件（http： ／／TCMSPnw.com ／default）对射干药材中黄酮类成分进行口服利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug－likeness，DL）分析，结果鸢尾甲黄素A综合得分最高，OB值约为64%，提示口服利用度良好；DL值为0.4，表明成为候选药物的可能性较大（当化合物的 DL≥0.18时即可作为候选药物）。但目前对鸢尾甲黄素A药理活性的相关研究鲜见报道。本研究中以脂多糖（LPS）刺激的小鼠RAW264.7细胞为炎症模型，观察鸢尾甲黄素A对炎性因子一氧化氮（NO）和白细胞介素6（IL－6）作用的影响，在细胞水平上探讨鸢尾甲黄素A的抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1仪器

W－CJ－1B型标准净化工作台（苏州净化设备厂）；CB150CE3型二氧化碳（三气）培养箱（路易企业有限公司）；XDS－500C型倒置显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）；400C型离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；酶标仪（美国柏腾仪器有限公司）；HH－S210R4型电热恒温水浴锅（上海锦屏仪器仪表有限公司）；Y－LS－50A型立式压力蒸汽消毒器（上海博迅实业有限公司）。

1.1.2试药

DMEM高糖培养基、10%胎牛血清、青霉素、链霉素（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；乙二胺四乙酸(EDTA)、噻唑蓝(MTT）、LPS，Sigma 公司；二甲基亚砜(DMSO）、台盼蓝(Typan Blue），Amerseco 公司；小鼠 NO及IL－6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）。鸢尾甲黄素A（江苏永健医药科技有限公司，批号为20140724）。细胞株为小鼠巨噬细胞RAW264.7（中国科学院上海细胞库）。

1.2 方法

1.2.1药物溶液配制

LPS溶液：取LPS粉末 5 mg，溶解在1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，制成质量浓度为5 g／L的LPS溶液，使用前用含有10%血清的DMEM培养液稀释至2 μg／mL即可。

鸢尾甲黄素A药液：取鸢尾甲黄素A适量，加DMSO溶解，用 PBS 稀释成质量浓度为 352，176，88，44，22，11，5.5 μg ／mL 的贮备液。

MTT 溶液：称取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，制成质量浓度为5 g／L的MTT溶液。

1.2.2细胞培养

将RAW264.7细胞置高糖DMEM培养基中，并加入 10% 青霉素及链霉素 100 mg ／L，在 95%O2、5%CO2、37℃条件下传代培养。

1.2.3MTT 试验

取对数生长期的RAW264.7细胞，制得细胞浓度为每1 mL含1×105个的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，培养过夜；吸弃各孔培养液，分组处理，即鸢尾甲黄素 A组分别加入 352，176，88，44，22，11，5.5 μg／mL 7 个质量浓度的药液，LPS 模型组加 LPS（2 μg ／mL）溶液；空白对照组加含 10% 胎牛血清的EMDM培养液，每组平行5孔，各孔加液终体积为200 μL，在 5%CO2、37 ℃ 条件下继续培养 24 h；然后在各孔加入 20 μL MTT 的 PBS 水溶液（5 g／mL），培养 4 h；吸弃培养液，每孔加入DMSO溶液150 μL振荡溶解。使用酶标仪在490 nm波长处测定吸光度（OD）值，计算各组细胞活力，并将空白对照组细胞活力记作100.00%；其他各组与对照组细胞的存活百分率进行比较。

1.2.4Griess试验

取对数生长期的RAW264.7细胞，制得细胞浓度为每1 mL含1×105个的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，培养过夜；吸弃各孔培养液，分组处理，即给药组分别加入 22，11，5.5 μg／mL 的 3个质量浓度药液，LPS模型组和空白对照组加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，每组平行5孔，各空加液体积为 200 μL，处理 1 h后，空白对照组加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液，其他各组均加LPS（2 μg ／mL）溶液，每孔加液体积为 100 μL，在 5%CO2及37℃条件下继续培养 24 h；吸取各孔培养液 50 μL，加入等体积的Griess试剂，室温反应10 min，用酶标仪在540 nm波长处测定 OD值，依据所测亚硝酸钠浓度，推算各组细胞培养液中NO含量，从而计算各药液组对LPS处理的细胞产生NO的抑制率。

1.2.5双抗体夹心ELISA法试验

细胞分组及处理等设计同1.2.4项，各组细胞培养24 h后，按照IL－6细胞因子的ELISA试剂盒说明书操作，吸取各孔培养液，用酶标仪在450 nm波长处测定OD，依据标准曲线，通过各组培养液中IL－6的含量计算抑制率。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件分析，组间数据比较采用 t检验。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响

MTT试验结果显示，随着鸢尾甲黄素A质量浓度的增加，RAW264.7细胞被抑制的效果越明显。与空白对照组细胞存活率相比，药物浓度在2.75～22 μg／mL范围内对RAW264.7细胞活力基本不产生影响。镜下观察，细胞状态良好，表明在此浓度范围内鸢尾甲黄素A无明显细胞毒性作用。因此，选择 22，11，5.5 μg ／mL 3个质量浓度继续进行试验（图1）。

图1 鸢尾甲黄素A对RAW264.7细胞活力的影响

2.2 对 LPS诱导小鼠 RAW264.7细胞分泌 NO的抑制

空白对照组细胞上清液中检测到的NO浓度非常低，仅为 2.1 μmol／L。予 2 μg ／mL LPS 刺激后，巨噬细胞释放大量的 NO （34.5 μmol／L），提示造模成功。与模型组相比，鸢尾甲黄素A作用的RAW264.7细胞上清液中，NO含量显著减少，结果表明，质量浓度在5.5～22 μg／mL范围内的鸢尾甲黄素A能明显抑制LPS诱导的 NO产生（图2）。

2.3 对LPS诱导小鼠RAW264.7细胞分泌IL－6的抑制

空白对照组细胞上清液中IL－6质量浓度为190.2 pg／mL，给予 2 μg ／mL LPS 刺激后，巨噬细胞释放 IL －6 的含量显著增加（5 819.2 pg／mL）。而与模型组相比，鸢尾甲黄素A 3个剂量组均可显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放IL－6，且具有明显的浓度依赖关系（图3）。

图2 鸢尾甲黄素A对巨噬细胞产生NO的影响

图3 鸢尾甲黄素A对巨噬细胞产生IL－6的影响

3 讨论

巨噬细胞是免疫效应细胞，在机体的免疫系统中起着非常重要的作用，也是体内启动炎症介质产生的中心细胞。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，也是革兰阴性菌的主要致病物质，也是引起严重感染的直接原因[6]。当机体发生炎性反应时，LPS通过MyD88分子等途径激活NF－κβ，启动一系列细胞因子及其生物活性分子如NO，TNF－α，IL－6等，促进巨噬细胞释放多种炎性因子参与反应。结果显示，2 μg／mL的LPS作用于RAW264.7细胞24 h后，细胞存活率为99.91%，表明对细胞无毒性作用，2 μg／mL 的 LPS RAW264.7 细胞与作用24 h后，NO和IL－6的释放量与空白对照组有显著性差异。因此，本试验中采用2 μg／mL的LPS作用于RAW264.7细胞。

NO是重要的天然免疫应答调节性效应分子，参与血管调节、神经传递、炎症与免疫反应等过程。NO由一氧化氮合酶（NOS）催化左旋精氨酸而产生，在病理情况下NO大量合成会引起急、慢性炎性反应，诱发组织损伤和病变，进而参与某些炎症性疾病的发生[7]。本研究结果显示，与空白对照组相比，LPS模型组NO的分泌量增加；鸢尾甲黄素A各组的NO量均低于LPS模型组。

IL－6是近年来研究较多的一种多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性和潜在的临床应用前景。本试验结果表明，2 μg／mL的LPS刺激巨噬细胞产生大量的IL－6，与空白对照组相比，有显著性差异；而与模型组相比，质量浓度在 5.5～22 μg／mL范围内的鸢尾甲黄素A能显著抑制由 LPS诱导的RAW264.7细胞释放IL－6，并呈现良好的浓度依赖关系。

[1]刘合刚.野生射干与栽培射干化学成分的定性比较[J].时珍国医国药，2001，12（8）：685 －686.

[2]秦民坚，吉文亮，王峥涛.射干的化学成分研究（Ⅱ）[J].中草药，2004，35（5）：487 － 489.

[3]邱鹰昆，高玉白，徐碧霞，等.射干异黄酮类化合物的分离与结构鉴定[J].中国药物化学杂志，2006，16（3）：175 －177.

[4]Woo WS，Woo EH.An isoflavone noririsflorentin from Belamcanda chinensis[J].Phytochemistry，1993，33（4）：939 － 940.

[5]秦文艳，赵金明，齐 越，等.射干提取物体内体外抑菌作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，27（4）：147 －150.

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Regulation EffectofIristectorigenin A on Secretion ofInflammatory Factor in Mouse RAW264.7 Cells Induced by Lipopolysaccharide

Zou Guixin1， Sun Xiaoling2， Wang Guanghan1， You Xianmin1， Li Guoxin1
（1.Liaoning Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Shenyang， Liaoning， China 110034； 2.Liaoning Provincial Institute for Drug Control and Inspection，Shenyang，Liaoning，China 110023）

Objective To investigate the regulation effect of iristectorigenin A on secretion of inflammatory factors （NO and IL －6） in mouse RAW264.7 macrophage cells induced by lipopolysaccharide（LPS）.Methods LPS was adopted to induce RAW264.7 macrophage cells in order to establish the model of cellular inflammatory response.Different concentrations of iristectorigenin A were used to intervene the RAW264.7 macrophage cells，and the blank control was set.The effects of different concentrations of iristectorigenin A on the viability of RAW264.7 cells were determined by MTT method，the production of NO was detected by Griess method，and the content of inflammatory factor（IL － 6） in cell supernatant was detected by ELISA.Results Iristectorigenin A can significantly inhibit the production of NO and IL －6 in RAW264.7 cells induced by LPS,and the concentration of the action was in a concentration dependent manner.Conclusion The anti－ inflammatory effect of iristectorigenin A may be related to the reduction of the production of inflammatory factors（NO and IL － 6）.

iristectorigenin A；lipopolysaccharide；RAW264.7 cell；NO；IL － 6；mouse

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)22－0001－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.22.001

国家自然科学基金[81273927]；国家“重大新药创制”项目[SQ2017ZX090328]。

邹桂欣（1965－），女，研究员，研究方向为中药药效物质基础，（电子信箱）zou650430＠126.com。

李国信（1963－），男，博士研究生，博士研究生导师，研究方向为中药新药开发，（电子信箱）yying＿65＠126.com。

2017－06－06)