胰腺实性-假乳头状肿瘤和神经内分泌肿瘤中Claudin5和Claudin7的表达及意义

曹 钟，魏建国，岑红兵，刘立红，常慧芳，敖启林

·短篇论著·

胰腺实性-假乳头状肿瘤和神经内分泌肿瘤中Claudin5和Claudin7的表达及意义

曹 钟1，魏建国2，岑红兵1，刘立红3，常慧芳4，敖启林5

目的探讨Claudin5和Claudin7在胰腺实性-假乳头状肿瘤(solid-pseudopapillary neoplasm, SPN)、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor, NET)中的表达及意义。方法采用免疫组化EnVision法检测20例SPN和23例NET中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR、Claudin5和Claudin7的表达。结果(1)在SPN和NET中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR呈不同程度阳性表达。其中，β-catenin和CD10在SPN和NET中的阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，β-catenin诊断SPN的敏感性为90.0%，特异性为52.2%；CD10诊断SPN的敏感性为80.0%，特异性为69.6%。其余6种标志物差异无统计学意义(P>0.05)。(2)Claudin5在SPN中的阳性率为100%(20/20)，明显高于NET(13.0%，3/23)，差异有统计学意义(P<0.05)；其诊断SPN的特异性(100%)和敏感性(87.0%)均高于β-catenin和CD10。(3)Claudin7在胰腺NET中的阳性率为100%(23/23)，而在所有SPN中均不表达；其诊断NET的特异性和敏感性均为100%。结论Claudin5和Claudin7分别在SPN和NET中呈肿瘤细胞胞膜阳性表达模式，是两者的免疫组化特征。联合检测Claudin5、β-catenin、CD10和Claudin7有助于诊断和鉴别诊断SPN和NET。

胰腺肿瘤；实性-假乳头状肿瘤；神经内分泌肿瘤；Claudin5；Claudin7

胰腺实性-假乳头状肿瘤(solid-pseudopapillary neoplasm, SPN)较少见，其发病率占所有胰腺肿瘤的2%～3%，9%～15%患者可能发生转移和局部侵犯。胰腺神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor, NET)是一种相对少见的肿瘤，占所有胰腺肿瘤的1%～2%，具有比SPN更广的生物学谱系。由于两者形态学极其相似，部分SPN会发生神经内分泌分化，因此有必要采用免疫组化法鉴别两者。传统的免疫组化标志物特异性不高，时常给鉴别诊断带来困难。Claudin蛋白是紧密连接(tight junction)蛋白家族，在许多肿瘤的发生、发展中扮演重要角色，近年来发现其在鉴别胰腺肿瘤中具有一定的意义。本文采用免疫组化EnVision法检测20例SPN和23例NET中Claudin5和Claudin7中的表达，探讨两者对鉴别诊断SPN和NET的意义。

1 材料与方法

1.1材料收集湖北省黄冈市中心医院、武汉市中心医院和浙江省绍兴市第一人民医院2009年8月～2016年6月期间手术切除的20例SPN和23例NET标本。SPN诊断标准参照WHO(2010)消化系统肿瘤分类[1]。NET的诊断标准按照(2017)胃肠胰神经内分泌肿瘤病理诊断规范[2]，依据核分裂象(<2；≥2，≤20；>20)和Ki-67阳性指数(≤2%；>2%，≤20%；>20%)将高分化神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tunor, NET)组织学分为G1(低)、G2(中)和G3(高)。所有病例均由两名高年资病理医师复核。

1.2方法所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水透明浸蜡切片，HE染色，同时行免疫组化染色。对所有标本行免疫组化EnVision两步法检测，所用一抗包括Claudin5兔单克隆抗体(购自Abcam公司，ab15106，稀释度1 ∶500)、Claudin7兔单克隆抗体(Abcam公司，ab27487，稀释度1 ∶1 000)。β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR均为工作液，二抗和DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司。Claudin5和Claudin7抗体经1 mmol/L pH 9.0的EDTA缓冲液，其余抗体经10 mmol/L pH 6.0枸橼酸缓冲液高压抗原修复后，按照使用说明书进行操作。用已知Claudin5阳性的血管瘤、Claudin7阳性的食管鳞状细胞癌作阳性对照，用PBS取代一抗作阴性对照。

1.3结果判定所有一抗的染色强度进行半定量分级，根据肿瘤细胞膜、质及核中出现黄色、棕黄色及棕褐色颗粒，观察每张切片中10个具有代表性的高倍视野，计算肿瘤细胞数，阳性结果评分分为2类：0～5%为阴性(-)；≥5%为阳性(+)。

1.4统计学分析所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。两种肿瘤单个免疫标志物阳性率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床特征20例SPN中，男性3例，女性17例；年龄10～48岁，中位年龄27岁；肿瘤直径4.6～8.5 cm；其中肿瘤位于胰头6例、胰体6例、胰尾8例；4例发生出血、囊性变；5例发生周围纤维包膜侵犯；1例腹腔转移。8例患者有腹痛、腹胀等症状，12例体检时被偶然发现。23例NET中，男性12例，女性11例；年龄32～57岁，中位年龄43岁；肿瘤直径1.4～4.8 cm；其中位于胰头5例、胰体11例、胰尾7例；组织学分级：G1型13例、G2型10例；1例发生出血、坏死；15例为无功能性肿瘤，8例有相应的临床症状；所有病例均未见转移。

2.2镜检20例SPN主要由实性区、假乳头区及退变区呈不同比例构成，部分外层见纤维包膜。实体区见肿瘤细胞呈大片巢状、条索状排列，分布于玻璃样变的纤维血管间。肿瘤细胞大小较一致，异型性小，圆形或椭圆形，细胞质较少、淡染，核圆形，可见核沟，未见核仁，少见核分裂。假乳头区见肿瘤细胞呈单层或多层排列，围绕纤维血管为轴心形成假乳头状或假菊形团结构，细胞形态与实体区相似。退变区可见出血、坏死，常见组织细胞浸润及胆固醇结晶。肿瘤内见残存的胰腺腺泡及导管。23例NET未见包膜，肿瘤细胞呈实体样、梁状、腺样及脑回样结构排列，间质为纤维组织，部分玻璃样变。肿瘤细胞大小、形态一致，呈圆形或卵圆形，胞质少。

2.3免疫表型

2.3.1Claudin5诊断SPN的特异性和敏感性 Claudin5在SPN的肿瘤细胞中均呈弥漫强阳性膜表达(图1A、B)，其阳性率为100%(20/20)；Claudin5在23例NET中阳性率为13.0%(3/23)，呈胞质阳性表达(图1C)，强弱不等；其阳性率在两肿瘤之间差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。Claudin5在诊断SPN中的敏感性为100%，特异性为87.0%；此外，本组实验亦发现Claudin5在43例胰腺肿瘤间质血管的内皮细胞中均呈胞质弥漫强阳性表达(图1D)。

2.3.2Claudin7诊断胰腺NET的特异性和敏感性 Claudin7在20例SPN肿瘤细胞中均不表达(图2A)，阳性率为0.0(0/20)；Claudin7在23例NET中的阳性率为100%(23/23)，呈弥漫强阳性膜表达(图2B)，两者之间差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。Claudin7诊断NET的敏感性为100%，特异性为100%。

2.3.38种常规标志物在SPN和NET中表达的差异性 SPN中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR的阳性率分别为90.0%(18/20)、80.0%(16/20)、65.0%(13/20)、95.0%(19/20)、80.0%(16/20)、90.0%(18/20)、75.0%(15/20)、70.0%(14/20)；NET中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR的阳性率分别为47.8%(11/23)、30.4%(7/23)、69.6%(16/23)、78.2%(18/23)、82.6%(19/23)、95.7%(22/23)、87.0%(20/23)、60.9%(14/23)。其中β-catenin和CD10在SPN和NET中的阳性率差异有统计学意义(P均<0.05)；β-catenin诊断SPN的敏感性为90.0%，特异性为52.2%；CD10诊断SPN的敏感性为80.0%，特异性为69.6%。其余CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR在SPN和NET中的阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05，表1)。

①A①B①C①D②A②B

图1Claudin5的表达模式：A.胰腺实性-假乳头状肿瘤假乳头状区域中的表达；B.胰腺实性-假乳头状肿瘤实性区域中的表达；C. 胰腺神经内分泌肿瘤中的表达；D.胰腺肿瘤间质血管内皮细胞中的表达，EnVision法图2Claudin7的表达模式：A.胰腺实性-假乳头状肿瘤中的表达；B.胰腺神经内分泌肿瘤中的表达，EnVision法

表1 10种标志物在SPN和NET中的阳性率差异性

3 讨论

SPN于1959年由Frantz首先报道。其曾经被认为良性肿瘤，该肿瘤曾被命名为胰腺实性-乳头状囊性肿瘤、乳头状囊性肿瘤、Hamoudi或Frantz瘤。WHO(2010)消化系统肿瘤分类将该肿瘤命名为SPN[1]，认为其是一种低级别恶性肿瘤。关于SPN的组织学发生目前处于争议之中，多数学者认为其起源于胰腺原始多功能干细胞或胚胎神经嵴细胞[3]。SPN的大多数患者为年轻女性，多数患者无明显症状，偶尔体检发现肿瘤。周围神经、胰腺间质和淋巴血管侵犯可以预测患者的预后，但并不能提示恶性。患者为男性、年龄较轻、肿瘤直径>5 cm及肿瘤核分裂象增多则会提示肿瘤为恶性[4]。大体观察SPN被纤维组织包裹，与周围正常的胰腺组织分界清楚；镜下组织形态学特点包含实体区、假乳头状结构及囊性变。当SPN肿瘤体积较小且发生神经内分泌分化或者肿瘤完全由实体区构成时，则与胰腺高分化NET鉴别较困难。SPN的假乳头状结构与NET的腺样结构或假菊形团结构容易混淆。SPN的玻璃样变间质与NET淀粉样间质也不易区分。在细胞学方面：虽然SPN肿瘤细胞中出现大的、清晰的细胞质空泡变性和Cercariform细胞有助于区分NET[5]。但是，两者具有更多相似的细胞学特征，如两者均具有从中等到较多的细胞数量，大小、形态一致，均可呈多角形、立方状，细胞质嗜酸性或透明，偶尔呈现浆细胞样外观，细胞核呈圆形或卵圆形，核质比较低，核分裂少见，具有明显的核仁[6]。由于两者的生物学行为不同，采用免疫组化法检测必不可少。目前，诊断和鉴别SPN和NET标志物主要有P504S、CD10、E-cadherin/β-catenin、CK、Axin-1、vimentin、PR、AAT、Syn、CgA及CD56等。

Claudin蛋白属于完整的紧密连接(tight junction, TJ)膜蛋白家族成员，在维持上皮细胞极向、黏附性和细胞旁通透性中起重要作用，与细胞某些功能失常和肿瘤的发生密切相关。目前在哺乳动物中已经发现有24余种Claudin蛋白。除Claudin13外，人类有23种Claudin基因得到识别和定位。相比正常的组织，Claudins蛋白在不同的肿瘤组织中呈现不同的表达模式，部分蛋白表达下降或者过表达均与肿瘤的发生及患者的预后有关，可能是肿瘤治疗的靶位[7]。Claudin5在TJ蛋白中起内皮细胞屏障功能，通过直接调节ERG基因转录从而发挥作用，其在大脑、肺的所有节段的血管内皮细胞和肾脏入球小动脉、出球小动脉中呈过表达[8]。通过对本组43例胰腺肿瘤检测，发现所有的肿瘤间质中的血管内皮细胞质均可见Claudin5表达，与文献报道相符。Claudin7蛋白在许多肿瘤组织中出现下调，其表达减少诱导肿瘤细胞失去钙黏附蛋白，促进细胞增生、侵袭；同时，其还可以通过ERK/MAPK细胞信号转导途径抑制肿瘤细胞迁徙和侵袭[9]。近年来，有学者发现Claudin5和Claudin7可以用来鉴别胰腺的SPN和NET。Comper等[10]检测20例胰腺SPT、20例无功能内分泌肿瘤、7例腺泡细胞癌和2例胰母细胞瘤发现Claudin5在所有的SPT中呈强阳性膜表达，Claudin7则在少数病例中呈胞质阳性表达；相反，所有的内分泌肿瘤、腺泡细胞癌和胰母细胞瘤则呈Claudin7强阳性膜表达，Claudin5则全部为阴性；因此，这种表达模式有助于区分SPT和其他胰腺肿瘤。国内郑洪彦等[11]发现Claudin5具有相同的鉴别作用。然而，也有学者认为Claudin7在细胞质中呈阳性是SPN的独特特征[12]。本组实验结果表明：20例SPN均呈Claudin5膜强阳性表达，其阳性率为100%(20/20)，3例NET呈Claudin5胞质阳性表达，染色信号强弱不等；23例NET均呈Claudin7胞膜强阳性，其阳性率为100%(23/23)，Claudin7在所有SPN中均阴性。Claudin5和Claudin7在两者中的阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)。Claudin5诊断SPN的敏感性为100%，特异性为87.0%；Claudin7诊断胰腺NET的敏感性为100%，特异性为100%。作者推测Claudin5和Claudin7在胰腺SPT和NET的不同表达模式可能与两种蛋白分别参与不同肿瘤细胞间的黏附性有关。

在SPN中普遍发生的Wnt/β-catenin信号通路异常从而导致CTNNB1外显子3中的β-catenin基因激活是重要的分子机制，因此Wnt/β-catenin信号通路是SPN的致瘤因子[13]。联合检测E-cadherin/β-catenin和CD10有助于诊断和鉴别诊断SPN和NET。本实验结论支持上述结论。其余CD99、CK、Syn、CgA、CK、PR、AAT等标志物在不同研究中结论不同[14-15]，在两种肿瘤中出现的免疫表型重叠，鉴别仍旧存在困难。Claudin5和Claudin7分别在SPN和NET中呈肿瘤细胞膜的阳性表达模式，具有较高的特异性和敏感性，本实验通过联合检测Claudin5、β-catenin、CD10和Claudin7可以有效地鉴别SPN和NET。

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1001-7399(2017)10-1122-04

时间：2017-10-23 13:30 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.014.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.014

接受日期：2017-05-25

1湖北省黄冈市中心医院病理科，黄冈 438000

2浙江省绍兴市第一人民医院病理科，绍兴 312000

3湖北省武汉市中心医院病理科，武汉 430010

4湖北省武汉市第六医院病理科，武汉 430000

5华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所/同济医学院病理学系，武汉 430030

曹 钟，男，硕士，副主任医师。Tel: (0713) 8625273，E-mail: caozhong1980@sina.com

敖启林，男，副教授，硕士生导师，通讯作者。E-mail: aoqilin@263.net