毛白杨PtDET2基因的克隆及其在烟草中的抗旱与耐盐功能分析

雷雨婷 ，姚新转 ，吕立堂，2* ，赵德刚，3*

(1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州省农业科学院，贵州 贵阳 550006)

毛白杨PtDET2基因的克隆及其在烟草中的抗旱与耐盐功能分析

雷雨婷1，姚新转1，吕立堂1，2*，赵德刚1，3*

(1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州省农业科学院，贵州 贵阳 550006)

类固醇5α-还原酶基因(steroid 5α-reductase 2， DET2)是油菜素内酯合成的关键基因，在抵抗非生物胁迫伤害中起着重要的作用。本研究克隆了杨树(PopulusL)PtDET2基因，cDNA编码区全长774 bp，编码257个氨基酸；进化树分析表明，PtDET2基因编码的氨基酸序列与碧桃(Prunuspersica)相似性为78%。构建植物表达载体pSH737-35S-PtDET2，利用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的叶盘法遗传转化烟草。选取3个转基因株系TP10、TP12和TP15，用不同浓度甘露醇和NaCl模拟干旱胁迫和盐胁迫，对其种子发芽率和幼苗期进行耐旱性和耐盐性分析。结果发现，在300 mmol/L甘露醇处理15 d，种子发芽率比野生型高40%以上，通过观察苗期根的生长发现，野生型植株根系生长明显受到抑制；在200 mmol/L NaCl处理种子15 d，转基因植株种子发芽率比野生型高50%以上，野生型植株根系生长也受到明显的抑制。分别用20% PEG 6 000和200 mmol/L NaCl处理转基因植株和野生型植株(0、1、3、5和7 d)，结果显示，在干旱和盐胁迫下，转基因植株的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， SOD)、过氧化氢酶(Catalase， CAT)和过氧化物酶(Peroxidase， POD)的活性均显著高于野生型，丙二醛(Malondialdehyde， MDA)含量显著低于野生型植株。因此，PtDET2基因表达提高了烟草植株的耐旱与耐盐能力，研究结果为进一步探讨该基因功能提供依据，为创制转基因耐旱和耐盐提供基础资料。

PtDET2基因；同源序列比对；耐旱性；耐盐性

干旱已成为现代农业面临的主要问题之一，干旱使农作物的生长发育受到严重阻碍，给我国粮食安全和社会经济造成巨大的损失[1]。土壤中盐分过多也会严重影响植物的生长发育，不仅会使农作物减产，也会降低土地有效使用面积[2]，严重威胁我国农业生产持续性发展，因此培育抗旱耐盐作物品种是解决干旱盐渍地的一条经济有效的途径[3]。

油菜素内酯又称芸苔素内酯(brassinolides， BRs)，能调节植物的生长发育，如细胞的分化、茎的伸长、果实成熟和植物光合作用等，在重金属胁迫、低温胁迫、干旱胁迫和盐胁迫等非生物胁迫下，油菜素内酯也起着十分重要的作用[5，6，21-23]。近年来，研究者通过对一些突变体的研究基本弄清楚了油菜素内酯生物合成途径以及代谢途径，发现det2、cpd、dwf5、dwf7等多个基因参与油菜素内酯的合成。其中det2的突变体会导致植物出现黄化、矮化等特征，下游产物降低，外施油菜素内酯可以恢复表型，因此类DET2基因被认为是BRs生物合成途径重要的限速酶[7]。DET2基因已在多个物种得到鉴定，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)和棉花(Gossypiumspp)等[6，10，19]。毛白杨在中国境内分布广泛，生长条件要求不严，喜深厚肥沃、稍耐碱。pH值8.0～8.5时亦能生长，大树耐湿。耐烟尘，抗污染。深根性，根系发达，萌芽力强，生长较快。长期以来被广泛用于速生防护林、“四旁”绿化及农田林网树种，并起到了很好的效果，本研究利用现代分子生物学技术，克隆杨树DET2基因并构建植物表达载体，利用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法遗传转化烟草(Nicotianatabacum)，对转基因株系进行抗旱性及抗盐性分析，为改良植物新品种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

杨树品种为毛白杨741，烟草品种为Xanthin，种植在贵州大学农业生物工程研究院农场。

1.2基因克隆与载体构建

选用拟南芥的类固醇5α-还原酶基因(AtDET2：GenBank登录号：U53860)的氨基酸序列作为探针，用tBLASTn程序对GenBank中的杨树EST序列进行同源比对，并在DNASTAR(DNASTar，Masison，WI)中进行整合。根据整合后的cDNA序列用Primer Premier 5.0设计引物并合成。用高保真酶Primer SRAR HS DNA Polymerase 进行基因扩增，胶回收后，得到目的条带，再与pMD19-T Vector连接，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞，测序由上海潍捷基生物技术公司测序。质粒载体pSH737由农业生物工程研究院保存，用XbaI单酶切后用T4DNA连接酶连接，即获得植物表达载体pSH737-35S-PtDET2，35S启动子驱动NPTII：GUS融合基因和报告基因(图1)。

RB：T-DNA右边界；35S：CaMV 35Spoly A；tNOS：终止子；LB：T-DNA左边界图1 植物表达载体pSH-35S-PtDET2结构Fig.1 Structure of transformation vector pSH-PtDET2 used in the study

1.3PtDET2基因cDNA编码产物同源序列比对分析

在NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索出不同物种的类固醇5α-还原酶基因，并与PtDET2基因序列排列比较(DNAStar，MegAlign Program，Clustal W method)。利用DNAStar软件进行系统进化分析。

1.4遗传转化

以烟草叶片为外植体，通过农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的共转化法[9]9进行遗传转化，共培养2 d后转入含有卡那霉素的筛选培养基上培养14 d左右，待叶缘出现绿色的愈伤组织后，继代培养诱导产生抗性芽，将抗性芽切下置于生根培养基上诱导生根，待苗长至3～6 cm后炼苗并移栽至花盆中培养。

1.5胁迫处理

干旱胁迫处理：将转基因T0代呈阳性的转基因及其野生型植株移栽至花盆(营养土∶蛭石=3∶1)，浇20%聚乙二醇6 000 (polyethylene glycol， PEG)进行干旱处理，分别处理不同的时间(0、1、3、5和7 d)，剪取叶片保存于-80 ℃中待用。选取T1代植物中TP10、TP12、TP15和WT的种子经过75%乙醇30 s、H2O210 min表面消毒，无菌水冲洗5～6遍后，接种于分别加有0、150和300 mmol/L甘露醇的MS培养基上萌发，观察并记录种子的萌发情况，15 d后进行统计拍照。每组试验重复三次。

盐胁迫处理：将转基因T0代呈阳性的转基因植株以及野生型移栽至花盆(营养土∶蛭石=3∶1)，浇200 mmol/L的NaCl进行盐胁迫处理，分别处理不同的时间(0、1、3、5和7 d)，剪取叶片保存于-80℃中待用。种子消毒同上，选取T1代植物中TP10、TP12、TP15和WT的种子接种于分别含有0、100和200 mmol/L NaCl的MS培养基上萌发，观察并记录种子的萌发以及生根情况，15 d后进行统计拍照。每组试验重复三次。

1.6生理指标的测定

超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase， SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量、过氧化氢酶(catalase， CAT)活性和过氧化物酶(peroxidase， POD)活性使用酶标仪测定。选取生长状况一致的转基因烟草与野生型烟草各三株，称取0.1 g混合组织，进行液氮研磨均匀，加入1 mL提取液，8 000×g 4℃离心10 min，取上清，置冰上，实验步骤参考苏州科铭生物技术有限公司试剂盒的说明书，转基因植株与野生型植株均为混合样，试验重复三次。

1.7实验数据的统计学分析

数据分析使用Excel 2010软件，分别计算均值及标准误差并绘制图表。采用SPSS19.0统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1PtDET2基因序列同源比对及进化树分析

克隆得到的PtDET2序列与数据库CDS序列一致(XP 002323554.1)，PtDET2cDNA 序列进行Blastp分析，结果显示，其蛋白结构域与碧桃 (Prunuspersica， XP_007208557.1)相似性为78%，与麻风树(Jatrophacurcas，XP_012087922.1)相似性为77%，与陆地棉(Gh，NP_001314480.1)相似性为73%，与拟南芥(Arabidopsislyratasubsp，XP_002881561.1)相似性为69%，(图2)。选取有代表性的物种氨基酸序列进行系统进化树分析，结果显示，在进化过程中与碧桃和麻疯树有较高的同源性(图3)。

2.2转基因株系种子的抗旱性与抗盐性分析

将野生型和转基因烟草(TP10、TP12和TP15)种子消毒后播种于含有不同浓度甘露醇的培养基上进行干旱胁迫，分别在第0、5、10和15 d统计发芽率，结果表明，当甘露醇浓度为300 mmol/L，转基因株系发芽率极显著(P<0.01)高于野生型株系，胁迫时间为15 d时，转基因株系发芽率都在70%左右，而野生型株系发芽率不到20%。结果表明，在含有甘露醇的MS(Murashige and Skoog)培养基上，转基因株系表现出一定的抗旱性(图4)。

将野生型和转基因烟草(TP10、TP12和TP15)种子消毒后播种于含有不同浓度NaCl的培养基上进行盐胁迫，分别在第0、5、10和15 d统计发芽率，结果表明，当NaCl浓度为200 mmol/L的时候，转基因株系发芽率极显著(P<0.01)高于野生型株系，第15 d时，转基因株系发芽率在60%以上，而野生型株系发芽率不到20%。结果表明，在含有NaCl的MS培养基上，转基因株系表现出一定的抗盐性(图5)。

注：黑色表示相同残基；红色表示保守替换；绿色表示半保守替换

Note：Black represents the same residue； red represents a conservative alternative； green represents a semi conservative alternative

图2 与其他物种的蛋白质序列同源比对
Fig.2 Homologous analysis of protein sequences among differentspecies

2.3转基因植株幼苗抗旱性和抗盐性分析

在含有0、150和300 mmoL/L甘露醇的竖直平板上生长15 d(图6)，转基因和野生型植株幼苗的根系生长状况不同，随着甘露醇浓度的升高，转基因和野生型植株的根系都受到了抑制，野生型植株在甘露醇胁迫下受到更加明显的抑制，表明转PtDET2基因烟草植株比野生型植株耐旱。

图3PtDET2与其他类固醇5α-还原酶的系统进化分析

Fig.3 Phylogentic relationship ofPtDET2 with steroid 5α-reductases of other species

注：不同浓度0(B)、100(D)和200mmol/L(F) NaCl处理种子发芽率；“*”分别表示所测定项目在转基因与野生型植株之间差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。下同。

Note：The seed germination rates were treated with different concentrations of 0 (B), 100 (D) and 200 mmol / L (F) NaCl；“*”The differences between the transgenic plants and wild type plants were significant(P<0.05) and very significant(P<0.01), respectively. The blow same.

图4 种子萌发阶段用不同浓度0(A)、150(C)和300mmol/L(E)Mannitol处理种子发芽情况
Fig.4 Seed germination of 0(A)、150(C) and 300mmol/L(E) Mannitol at different concentrations in the seed germination stage

图5 种子萌发阶段用不同浓度0(A)、100(C)和200mmol/L(E) NaCl处理种子发芽情况Fig.5 Seed germination of 0(A)、150(C) and 300mmol/L(E) NaCl at different concentrations in the seed germination stage

在含有0、100和200 mmoL/L NaCl的竖直平板上生长15 d(图7)，转基因和野生型植株幼苗的根系生长状况不同，随着NaCl浓度的升高，转基因和野生型植株的根系都受到了抑制，野生型植株在200 mmoL/L NaCl浓度下根长缩短更加明显，表明转PtDET2基因烟草植株比野生型植株耐盐。

2.4转PtDET2基因对植株生理生化指标的影响

在自然条件下，转基因与野生型植株移栽一个月后，选择生长状况基本一致的烟草植株，用20%PEG 6000模拟干旱处理，用200 mmol/L NaCl溶液模拟盐处理，处理时间为0、1、3、5和7 d，分别取样样后进行生理生化指标的测定。

图6 不同浓度Mannitol(0，150，300 mmol/L)胁迫下转基因和野生型植株根的变化
Fig.6 Changes of Mannitol(0，150，300 mmol/L) stress transgenic and wild type plant roots under different concentrations of Mannitol

图7 不同浓度NaCl(0，100，200 mmol/L)胁迫下转基因和野生型植株根的变化Fig.7 Changes of NaCl(0，100，200 mmol/L) stress transgenic and wild type plant roots under different concentrations of NaCl

在20%PEG 6 000胁迫下，随着处理时间的延长，转基因与野生型植株的POD活性均上升，转基因植株的POD酶活性高于野生型植株，当处理时间为15 d时，转基因植株的平均POD酶活性为299.43 U/g(鲜重，FW)，而野生型植株的POD酶活性为217.71 U/g FW；随着处理时间的延长，转基因植株的SOD酶活性迅速升高，并显著(P<0.01)高于野生型植株，第5 d转基因植株的SOD活性是野生型的2.7倍；转基因植株与野生型植株的CAT酶活性随着处理时间的延长迅速上升，处理1 d时转基因植株CAT酶活性是野生型植株的2.7倍，处理时间为5 d时，转基因植株CAT酶性活性为2.6倍，均显著性高于野生型植株；随着处理时间的延长，野生型植株MDA含量迅速升高，转基因植株MDA含量升高缓慢，综上结果表明，干旱胁迫下转基因植株具有更强的活性氧清除能力。

在NaCl胁迫下，随着处理时间的延长，转基因与野生型植株的POD活性均上升，转基因植株的POD酶活性高于野生型植株，当处理时间为7 d时，转基因植株的平均POD酶活性为442.52 U/g(鲜重，FW)，而野生型植株的POD酶活性为223.26 U/g FW；随着处理时间的延长，转基因植株的SOD酶活性迅速升高，并显著(P<0.01)高于野生型植株，第5 d转基因植株的SOD活性比野生型提高59.80%；转基因植株与野生型植株的CAT酶活性随着处理时间的延长迅速上升，处理5 d时转基因植株CAT酶活性比野生型植株提高64.20%，显著(P<0.01)高于野生型植株；随着处理时间的延长，野生型植株MDA含量迅速升高，转基因植株MDA含量升高缓慢，综上结果表明，盐胁迫下转基因植株具有更强的活性氧清除能力。

图8 干旱胁迫下转基因株系和野生型烟草POD活性、SOD活性、CAT活性和MDA含量Fig.8 The POD activaty， SOD activaty， CAT activaty and MDA content of transgenic and wild type tobacco under drought stress

图9 盐胁迫下转基因株系和野生型烟草POD活性、SOD活性、CAT活性和MDA含量Fig.9 The POD activaty， SOD activaty， CAT activaty and MDA content of transgenic and wild type tobacco under salinity stress

3 讨 论

DET2 基因是油菜素内酯合成途径中的重要基因，而油菜素内酯在调控植物耐逆性方面具有重要作用，因此本研究通过改变植物体内油菜素内酯DET2基因的表达来研究其在作物抗旱和耐盐性方面的功能。结果表明，超量表达PtDET2基因提高了转基因植株的抗旱性，在300 mmol Mannitol 和200 mmol NaCl处理下，转基因植株的发芽率显著高于野生型，且野生型根的生长受到明显抑制作用。说明转PtDET2基因植株在模拟干旱胁迫和耐盐胁迫具有较强抗胁迫的能力。

在植物抵御逆境时，细胞内会产生一系列活性氧簇活性氧(reactive oxygen species，ROS)，如O2、H2O2等活性氧积累导致细胞膜过氧化和脱脂化，通透性增大，离子外流，当超出可耐的范围，植物将受害甚至导致死亡[12，18]。植物体中存在着保护酶系统，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等可以清除活性氧自由基，防止自由基的毒害，提高植物的耐受胁迫能力。在逆境胁迫下，细胞内的SOD能够专一清除细胞有氧代谢产生的过多的活性氧类，减轻或避免活性氧类对细胞的伤害，SOD活性与植物抗逆性呈正比[14]。同时POD和CAT作为植物体内抗氧化保护酶主要成员之一，其生理功能大多与胁迫作用导致的细胞膜损伤和破坏以及损伤信号转导等一系列生理生化变化有关[13，15]。本研究发现，在干旱与盐胁迫下，不同时间测得转基因植株的SOD和POD活性都要高于野生型，说明转PtDET2基因烟草具有更强的活性氧清除能力和及时的修复细胞损伤。MDA是植物细胞膜脂过氧化的最终产物之一，MDA的含量高低代表了植物生物膜受伤害的程度，含量越高说明植物细胞受到的伤害越大[16，22]。本研究干旱以及盐胁迫下，转基因植株的MDA含量增加，却显著低于野生型植株，说明转PtDET2基因可改善膜脂过氧化的状况并减轻受胁迫程度。

以上结果表明，植物细胞内自由基的产生与清除处于动态平衡中，但是植物在整个生长发育过程中会受到各种不良环境的影响，导致平衡遭到破坏，细胞产生大量的活性氧，破坏了膜脂的稳定性[17，20]。研究表明转PtDET2基因植株在模拟干旱胁迫以及盐胁迫条件下保护性酶活提高减少了细胞的破坏，提高了抗逆能力，为利用PtDET2基因提高植物抗旱抗盐性提供了参考。

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CloningofDET2fromAspen(PopulustomentosaCarr.)andAnalysisofSalinityandDroughtToleranceinTobacco(NicotianatabacumL)

LEIYu-ting1，YAOXin-zhuan1，LVLi-tang1，2*，ZHAODe-gang1，3*

(1．CollegeofLifeSciencesandTheKeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation)，InstituteofAgro-Bioengineering，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China； 2.CollegeofTeaScience，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China； 3.GuizhouAcademyofAgriculturalScience，Guiyang，Guizhou550006，China)

The steroid 5α-reductase gene is a key gene in the synthesis of brassinolide and plays an important role in abiotic stress tolerance. Currently， the steroid 5α-reductase 2 gene (PtDET2 ) were cloned from poplar (PopulustomentosaCarr.). Its coding region of the cDNA was 774 bp and encoded 257 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed that the sequence of the cDNA encoding the poplarPtDET2 gene was 78% similar to that ofPrunuspersica. The plant expression vector pSH737-35S-PtDET2 was constructed and transformed into tobacco usingAgrobacteriumtumefaciens-mediated leaf disc. Three different transgenic lines，i.e. TP10， TP12 and TP15 as well as the wild type， were subjected to the drought tolerance and salt tolerance of seed germination rate and seedling stage with different concentrations of mannitol and NaCl simulated drought stress and salt stress ， The results showed that the seed germination rate was more than 40% higher than that of wild type when treated with 300 mmol / L mannitol for 15 days. The growth of wild type plant roots was obviously inhibited by observing the growth of seedling roots. The seeds were treated with 200 mmol / L NaCl 15 d， the seed germination rate of transgenic plants was 50% higher than that of wild type， and the growth of wild type plant roots was also inhibited obviously. The transgenic plants and wild plants 0 d， 1 d， 3 d， 5 d and 7 d were treated with 20% PEG 6000 and 200 mmol / L NaCl respectively. The results showed that under drought and salt stress， the superoxide dismutase， The activities of enzymes and peroxidase were significantly higher than those of wild type， and the content of malondialdehyde was significantly lower than that of wild type plants. Studies have shown thatPtDET2 gene expression may improve the drought tolerance and salt tolerance of tobacco plants. This study provides the basis for further study of the gene function， and provides the basic data for the establishment of transgenic drought tolerance and salt tolerance. (it should be considerably improved).

PtDET2 gene；homologous sequence alignment；drought resistance；salt resistance

·研究报告·

2017-07-06；

2017-09-20

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项子课题任务(2014ZX08010-003) 、国家自然科学基金(No. 31160149)和贵州省科技厅转基因专项(黔科2004NZ004)共同资助(项目已结题)。

*

吕立堂(1978-)，博士 副教授，主要研究方向：发育生物学和基因工程；E-mail： lvlitang@163. Com；

赵德刚(1961-)，博士，教授，主要研究方向：基因工程和生物技术等； E-mail： dgzhao@gzu.edu.cn。

Q812

A

1008-0457(2017)05-0006-08国际DOI编码10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.002