龙胆泻肝汤氯仿提取物抑制白念珠菌VVC临床株水解酶活性

濮燕屏　王霞　冯鑫　邵菁　吴大强　汪天明　汪长中

[摘要]该研究探讨龙胆泻肝汤氯仿提取物（CELX）对白念珠菌VVC临床株外分泌水解酶的影响。分别采用牛奶培养基、蛋黄培养基、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）培养基对15株白念珠菌VVC临床株进行分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）、磷脂酶（PL）、脂肪酶（Lip）阳性菌株的筛选；牛奶平板法、蛋黄平板法、吐温80平板法分别检测CELX干预后， Sap，PL与Lip的活性变化；qRTPCR 检测基因SAP1～7，10，PLB1～2，LIP3～6的表达量。结果可见，15株VVC临床株的Sap，PL均为阳性，11株Lip阳性菌株。随着CELX剂量的递增，与空白对照组相比，各含药培养基（牛奶培养基、蛋黄培养基、吐温80培养基）上菌落的沉淀圈逐渐减小，当药物达256 mg·L-1时，菌落沉淀圈几乎消失，酶活力显著减弱。qRTPCR 结果显示，256 mg·L-1CELX时，除SAP5，SAP6外，SAP1，SAP2，SAP3，SAP4，SAP7，SAP9，SAP10分别下调了62%，55%，62%，84%，61%，51%，68%；PLB1下调了67%；LIP3，LIP4，LIP6分别下调了51%，54%，55%。研究表明，CELX能抑制白念珠菌重要毒力因子天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶与脂肪酶的活性。

[关键词]龙胆泻肝汤氯仿提取物； 白念珠菌VVC临床株； 分泌型天冬氨酸蛋白酶； 磷脂酶； 脂肪酶

[Abstract]To investigate the inhibitory effect and mechanism of chloroform extracts from Longdan Xiegan decoction（CELX） against hydrolytic enzymes activity of Candida albicans isolated from vulvovaginal candidiasis（VVC） patients Secreted aspartyl proteinase（Sap）， phospholipase（PL） and lipase（Lip） positive strains were identified from 15 strains of C albicans with milk culture medium， egg yolk culture medium and tween80 medium， respectively Then， the activities of Sap， PL， and Lip were detected in the above media qRTPCR was used to detect the changes in gene expressions of aspartic protease（SAP17，10）， phospholipase B（PLB12） and lipase（LIP36） Secreted aspartyl proteinase and phospholipase of 15 VVC clinical strains were positive， and lipase of 11 strains were positive Compared with the blank control group， the drug CELXcontaining medium（milk medium， egg yolk culture medium， tween80 medium） experiment showed that the sedimentation of colonies decreased gradually in each culture medium with the increase of CELX dose When the concentration of CELX was 256 mg·L-1， the colony almost disappeared， which indicated the enzyme activity was significantly weakened The results of qRTPCR showed that SAP1， SAP2， SAP3， SAP4， SAP7， SAP9 and SAP10 were downregulated by 62%， 55%， 62%， 84%， 61%， 51%， 68%， respectively， except for SAP5 and SAP6； and PLB1， LIP3， LIP4， LIP6 were downregulated by 67%， 51%， 54%， 55%， respectively The findings suggested that CELX may inhibit the activities of Sap， PL， and Lip， which are important virulence factors of C albicans.

[Key words]chloroform extracts from Longdan Xiegan decoction（CELX）； Candida albicans isolated from vulvovaginal candidasis patients； secreted aspartyl proteinase（Sap）； phospholipase（PL）； lipase（Lip）

白念珠菌（Candida albicans，Ca）是一種常见的条件致病性真菌，在菌群失调或免疫力下降时可引起外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）、鹅口疮等黏膜感染，甚至系统性感染。白念珠菌的致病性与其多种毒力因子密切相关，其中分泌型天冬氨酸酶（secreted aspartyl proteinase，Sap）、磷脂酶（phospholipase，PL）、脂肪酶（lipase，Lip）等水解酶通过介导表型转换、黏附、免疫逃逸等环节在菌体入侵宿主过程中发挥重要作用[1]。中药复方龙胆泻肝汤在临床上常用于外阴阴道念珠菌病（VVC）的治疗[24]，但作用机制不详。课题组近期研究证实，该复方的氯仿提取物对白念珠菌具有明显的抑菌活性[5]，在此基础上，本实验拟进一步探讨龙胆泻肝汤氯仿提取物对白念珠菌VVC临床株的毒力因子Sap，PL，Lip等水解酶的作用，为其治疗VVC 提供实验依据。endprint

1材料

11菌株15株白念珠菌VVC临床株由合肥市第一人民医院妇产科陶瑞雪主任惠赠，科玛嘉显色培养基确定为白念珠菌，纯化后保存在沙氏固体培养基上。

12药物与仪器龙胆泻肝汤氯仿提取物（CELX）的制备按参考文献方法进行[5]。ABI7000荧光定量PCR仪（美国生物应用系统公司）。

13培养基的配制牛奶培养基：称取葡萄糖20 g，酵母粉2 g，KH2PO4 5 g，琼脂15 g加入蒸馏水1 000 mL，高压灭菌后冷却至45 ℃，加入10 g无菌脱脂奶粉，充分混匀后倒入无菌培养皿，4 ℃保存，备用。

蛋黄培养基：称取葡萄糖30 g，蛋白胨10 g，NaCl 575 g，CaCl2 055 g，琼脂15 g加入蒸馏水1 000 mL，调整pH至55～60，高压灭菌，冷却至45 ℃左右加入无菌蛋黄80 mL，充分混匀后倒入无菌培养皿，4 ℃保存，备用。

酯酶培养基：称取蛋白胨10 g，NaCl 5 g，CaCl2 055 g，琼脂15 g加入蒸馏水1 000 mL，高压灭菌后冷却至45 ℃，加入

5 mL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80），充分混匀后倒入无菌培养皿，4 ℃保存，备用。

2方法

21分泌型天冬氨酸酶（Sap）阳性菌株的筛选[6]微量移液器分别吸取15株VVC临床株的菌悬液5 μL滴加于已配好的牛奶培养基表面，37 ℃培养5 d。观察菌落周围有无沉淀圈，拍照，并用游标卡尺测量培养基上各菌落直径和沉淀圈直径，实验重复3次。

22磷脂酶（PL）阳性菌株的筛选[6]分别吸取15株VVC临床株的菌悬液5 μL滴加于蛋黄培养基表面，37 ℃培养72 h后观察结果。观察菌落周围有无沉淀圈，有沉淀圈者为阳性菌株，测量培养基上各菌落直径和沉淀圈直径，实验重复3次。

23脂肪酶（Lip）阳性菌株的筛选[6]分别吸取15株VVC临床株的菌悬液5 μL滴加于吐温80培养基表面，37 ℃培养5 d。测量培养基上各菌落直径和沉淀圈直径，实验重复3次。

24结果判定[6]Pz为菌落直径与总直径（菌落直径+菌落周围沉淀圈直径）的比值[5]，各类水解酶的活性大小可采用Pz來表示：Pz为1表示无酶活力，090～099表示弱酶活力，080～089表示中度酶活力，070～079表示强酶活力，069以下表示极强酶活力。菌株的Pz为3次实验测定值的平均值。通过比较各类水解酶的活性大小，从15株VVC临床株筛选出分泌型天冬氨酸酶、磷脂酶、脂肪酶活性均较强的临床株（CA09）进行下一步实验。

25平板法检测阳性菌株CA09的3种水解酶活性[6]分别在配制牛奶培养基、蛋黄培养基、吐温80培养基的过程中加入不同剂量的CELX药液，使得各培养基中CELX的终浓度分别为64，128，256 mg·L-1。微量移液器吸取CA09临床株的菌悬液5 μL分别滴加于含药的牛奶培养基、蛋黄培养基、吐温80培养基表面，同时设置空白对照组，37 ℃培养5 d。测量各培养基上的菌落直径和沉淀圈直径，计算Pz，结果判定同24项。

26qRTPCR法检测阳性菌株CA09的3种水解酶相关基因表达水平根据NCBI基因库查得所需基因序列，并用Primer Premier 50 软件设计所需引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物，各引物序列见表1。遵照TIANGEN公司FastQuant RT试剂盒（含gDNase）说明书的反应条件将提取的总RNA反转录成cDNA。

3结果

31分泌型天冬氨酸酶（Sap）阳性菌株的筛选15株白念珠菌VVC临床株Sap均为阳性，且Pz均小于069，显示酶活性均极强。见图1与表2。

32磷脂酶（PL）阳性菌株的筛选15株白念珠菌VVC临床株PL均为阳性，酶活性强度不一，其中有

A，B培养皿中均为Sap活性极强的阳性菌株。

3株为强酶活力，12株为极强酶活力。见图2与表2。

A，B培养皿中不同PL活性的阳性菌株。

33脂肪酶（Lip）阳性菌株的筛选15株白念珠菌VVC临床株Lip活性强度不均一，其中有4株Lip阴性，3株呈强酶活力，8株呈极强酶活力，见图3与表2。

A，B，C培养皿中不同Lip活性的菌株。

34CELX对阳性菌株CA09的Sap活力的影响在CELX干预下，随着用药浓度的递增，白念珠菌VVC临床株CA09的SAP酶分解牛奶培养基中蛋白质的能力逐渐受到抑制，培养基中形成的沉淀圈逐渐减小，当CELX为256 mg·L-1时，几乎无法观察到菌株形成的沉淀圈，见图4。

35CELX对阳性菌株CA09的PL活力的影响与空白对照组相比，随着CELX剂量的增加，蛋黄培养基中菌落的沉淀圈逐渐减小，64 mg·L-1和128 mg·L-1CELX的沉淀圈变化不明显，256 mg·L-1CELX的沉淀圈显著减小，几乎消失，见图5。

A空白对照组；B 64 mg·L -1CELX；C128 mg·L -1CELX；D256 mg·L -1CELX（图5，6同）。

36CELX对阳性菌株CA09的Lip活力的影响与空白对照组相比，随着CELX剂量的递增，吐温80培养基中菌落的沉淀圈逐渐减。CELX为64 mg·L-1时，沉淀圈变化不明显；128 mg·L-1时，沉淀圈较空白组显著减小；

256 mg·L-1时，菌落沉淀圈几乎消失，见图6。

37CELX对阳性菌株CA09的SAP基因表达水平的影响与空白对照组相比，SAP基因均呈现不同程度的下调。CELX在128 mg·L-1时，SAP1，SAP3，SAP4，SAP7分别下调了55%，59%，69%，57%；256 mg·L-1时，除SAP5，SAP6外，SAP1，SAP2，SAP3，SAP4，SAP7，SAP9，SAP10分别下调了62%，55%，62%，84%，61%，51%，68%，见图7。endprint

38CELX对阳性菌株CA09的PLB基因表达水平的影响与空白对照組相比，基因 PLB1，PLB2均有所下调。CELX在128 mg·L-1时，PLB1下调了55%；256 mg·L-1时PLB1下调了67%，见图8。

39CELX对阳性菌株CA09的LIP基因表达水平的影响与空白对照组相比，基因LIP5在不同浓度的CELX干预下均有所下调，但差异无统计学意义。128 mg·L-1CELX干预后，仅有LIP4下调了53%；CELX为256 mg·L-1时，LIP3，LIP4，LIP6分别下调了51%，54%，55%，见图9。

4讨论

龙胆泻肝汤出自《医方集解》，方中龙胆草大苦

大寒，泻火除湿；黄芩、栀子亦苦寒，泻肝胆湿热；木通、泽泻、车前子清利肝经湿热；生地黄、当归养血滋阴；柴胡疏畅肝胆之气，引诸药入肝胆经；甘草调和诸药。方中诸药合用，共奏泻肝胆实火，清下焦湿热。中医认为，外阴阴道念珠菌病（VVC）的“带下”、“阴痒”等表现多属肝经湿热内蕴，属龙胆泻肝汤主治范围[7]。故龙胆泻肝汤为历代医家治疗外阴阴道念珠菌病时所广为采用，但龙胆泻肝汤治疗VVC的作用机制尚不明确。

研究表明，VVC的致病机制与白念珠菌的侵袭力密切相关[89]。除菌丝及侵袭素（如ssa1，als3）外，分泌型天冬氨酶（Sap）、磷脂酶（PL）和脂肪酶（Lip）等水解酶是促进白念珠菌侵袭宿主的重要毒力因子。其中天冬氨酸酶（Sap）的有关研究最为多见，Sap家族由10个基因（SAP1～SAP10）编码，具有较强的蛋白水解活性，能水解多种宿主蛋白，如角蛋白、胶原蛋白和波形蛋白等细胞外基质蛋白以及细胞间黏连蛋白等，从而破坏宿主的防御机制，有助于白念珠菌对宿主组织的侵袭[1011]。Pericolini E等[12]发现，将Sap注射进小鼠阴道内，引起的炎症反应与菌体感染效果一样，且使用抗Sap抗体与蛋白酶抑制剂Pepstatin A治疗，能明显抑制Sap所引起的炎症反应，证明Sap在VVC中的重要性。除Sap外，磷脂酶（PL）通过影响宿主细胞脂类代谢而发挥重要作用，根据水解磷脂键的不同，PL可分为PLA，PLB，PLC，PLD 4型，其中PLB水解细胞膜中的磷脂，从而引起宿主细胞膜的通透性增高，白念珠菌透过受损的细胞膜侵入宿主细胞[1314]。此外，脂肪酶（Lip）催化甘油三酯的水解和合成，是白念珠菌另一个重要的毒力因子[1516]。

鉴于现有的抗真菌药物均以真菌的结构（如细胞壁、细胞膜等）为靶标而未见有以毒力因子外分泌酶为靶标的抗菌机制，故本实验未采取阳性药对照。实验通过特异性培养基筛选出同时满足Sap，PL，Lip活力均很强的阳性菌株CA09。其中Sap的活性检测采用牛奶培养基法，以脱脂奶粉作为唯一氮源，白念珠菌分泌的Sap对其水解的效果可直接通过培养基中的沉淀圈观测。白念珠菌分泌的PL可以将培养基中的蛋黄分解为脂肪酸，培养基中添加的钙成分能与之结合，在菌落周围形成肉眼可见的白色沉淀圈，沉淀圈的大小与酶的活力成正相关。

龙胆泻肝汤氯仿提取物（CELX）对所选菌株3类水解酶的实验结果显示，当CELX为256 mg·L-1时，Sap活力明显减弱，PL，Lip活力也被显著抑制，推测CELX能降低外分泌酶的活性而抑制白念珠菌对宿主组织的侵袭力。此外，还进一步通过实时荧光定量PCR法检测了CELX对Sap，PL，Lip相关基因表达的影响。

本实验中，当CELX为128 mg·L-1时，SAP1，SAP3，SAP4，SAP7基因出现不同程度的下调，且均具有显著性差异；当CELX为256 mg·L-1时，SAP4下调最显著，达到84%。在编码PL的2个基因PLB1，PLB2中，CELX对PLB1的作用比对PLB2的作用更明显。128 mg·L-1的CELX使PLB1下调了55%，256 mg·L-1时PLB1下调了67%。对于LIP，除基因LIP5下调差异无统计学意义外，LIP3，LIP4，LIP6在256 mg·L-1CELX作用下均呈现明显下调，分别下调了51%，54%，55%。综上，CELX对水解酶Sap，PL，Lip活力的抑制可能与其对该3种酶在基因水平上的下调相关。

目前，常规的抗真菌药物作用的靶点均在菌体结构性组成本身，如棘白菌素类作用于细胞壁，唑类或两性霉素B作用于细胞膜，5氟胞嘧啶作用于核酸等。这些药物长期作用下，由于选择压力，菌株易产生耐药性，且抗真菌药物的毒副作用均较大。选择对菌体本身影响不大而以其产生的毒力因子（如本文中白念珠菌的3种外分泌酶Sap，PL，Lip）为靶标的药物已成为近年来抗菌药物研发的新策略，因不直接针对病原体，故一般不会引起耐药突变株的产生，也不会导致菌群失调[1718]。由于本研究中的供试药为中药复方，其作用的有效成分或详细作用机制尚有待于进一步研究。

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[責任编辑张宁宁]endprint