三种酱油发酵曲霉酶活力的比较

谭永水，郭琳，刘新利*，侯丽华

(1.齐鲁工业大学 生物工程学院，济南 250353；2.天津科技大学新农村发展研究院，天津 300457)

三种酱油发酵曲霉酶活力的比较

谭永水1，郭琳2，刘新利1*，侯丽华2

(1.齐鲁工业大学 生物工程学院，济南 250353；2.天津科技大学新农村发展研究院，天津 300457)

制曲对酱油酿造至关重要，影响着酱油的品质。因此，本研究对酱油制曲过程中的米曲霉A、米曲霉沪酿3.042、米曲霉A100-8 3种曲霉在不同时间的酶活力进行了研究，包括酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶。结合酶活力的变化趋势、原料水解度以及酿造后期淋油的综合情况，最终确定在制曲42 h对3株曲霉所制备的大曲进行收曲，比较发现米曲霉A100-8在收曲时，各种酶活表现最佳。

酱油制曲；米曲霉A；米曲霉A100-8；米曲霉3.042；酶活

制曲直接影响酱油酿造的原料利用及品质形成，这一过程由可分泌多种酶系的曲霉主导完成。 作为底物的植物性原料性质决定了制曲过程多酶系配合的重要性。蛋白酶将原料中的蛋白质分解为氨基酸、低分子肽、多肽和胨，这些是酱油中非挥发性滋味物质及挥发性风味物质的前体。淀粉酶与淀粉糖化酶负责原料中淀粉的分解，对酱油品质有重大影响。如：糖化作用完全，酱油香气浓郁、甜味适当、体态浓厚、无盐固形物含量高，品质也较好[1]。纤维素酶使大豆细胞壁溶解，细胞膜膨胀软化破坏[2]，内溶物充分释放，增加原料利用率。果胶酶可降低酿造体系粘度，利于色素溶出及淋油过程，增加酱油色泽与感官度，促进多种香气的形成。研究表明：鲜味物质谷氨酸的累积量不仅与谷氨酰胺酶有关，还与亮氨酸氨肽酶有直接关系[3]。此外，米曲霉在大曲制备阶段产生大量的高活力植酸酶与磷酸酶协同释放曲料中的植酸结合磷，为发酵阶段酵母生长代谢提供所需磷酸盐。

本研究通过3种米曲霉在不同制曲时间产生的酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶8种酶活进行了比较，并确定最佳的收曲时间及表现最优的米曲霉，为后续的酱油发酵奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 原料及菌株

原料：麸皮、豆粕。

菌种：米曲霉A、米曲霉沪酿3.042、米曲霉A100-8为本实验室保藏。

1.2 实验方法

1.2.1 制曲工艺

1.2.1.1 三角瓶种曲的制备

从保藏的米曲霉的米曲汁斜面上挑取3～4环孢子，无菌条件下接种到制备好的三角瓶种曲培养基中，充分混匀，堆积后放置于32 ℃恒温培养箱中培养。

培养约15 h左右，将堆积培养的曲料打散，即为第1次摇瓶，以此达到二次接菌的目的，并将温度调至30 ℃，平铺培养。

培养约22 h后，进行第2次摇瓶，继续平铺培养。

培养约72 h后，自然风干，装入袋子中备用。

1.2.1.2 大曲的制备

取300 g大小均匀的黄豆，用自来水清洗3遍干净后，加入2.5倍水，浸泡12～15 h，至大豆子叶吸水完全，发白，无发暗。

将润水后的大豆沥干水分，用曲布包好装入不锈钢框内，放入压力灭菌锅内121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

灭菌后的曲料取出后，及时用手(带上已消毒的橡胶手套)将其打散，使其迅速降温。

待曲料温度降至40 ℃左右，按照黄豆∶面粉为6∶4(干重)的比例加入面粉，拌匀后混入原料重量0.3%的种曲。

将充分拌匀后的大曲放入30 ℃恒温培养箱中进行堆积培养，培养12～16 h，菌丝生长、结块正常、曲料品温达到38 ℃时进行第1次翻曲，确保温度降至30 ℃左右。培养过程控制湿度95%以上。

第1次翻曲后继续培养，培养大约6～8 h左右，曲料品温进一步上升至38 ℃时，进行第2次翻曲。

之后控制温度在28 ℃进一步培养至出曲。

1.2.2 大曲酶活力的测定

蛋白酶活力的测定根据SB/T 10317-1999[4]中的方法进行测定。淀粉酶活力的测定根据Young J Yoo等的方法进行测定[5]。糖化酶活力的测定根据Satheesh Kumar Gudi和孙淑琴等改良后的方法进行测定[6，7]。纤维素酶活力的测定根据Anuradha等的方法进行测定[8]。果胶酶活力的测定根据党敏娜的方法进行测定[9]。亮氨酸氨肽酶活力的测定根据李诗雯的方法进行测定[10]。谷氨酰胺酶活力的测定根据袁振远等的康维皿法进行测定[11]。植酸酶的测定根据彭益强的方法进行测定[12]。

2 讨论分析

2.1 蛋白酶活

曲霉具有的强大蛋白酶系是其最重要的特性。这些胞外酶将变性的蛋白质进行分解，使其从大分子水解为小分子物质。这在酿造过程中对原料的降解起到了至关重要的作用。根据国标的定义，在40 ℃下每1 min水解酪蛋白1 μg的酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。酱油发酵是在酸性条件下进行的，所以本研究测定了3种曲霉制备大曲过程中不同时间的酸性蛋白酶酶活力变化情况，见图1。

图1 酸性蛋白酶活力的变化Fig.1 The change of acid protease activity

由图1可知，在制曲24～36 h期间3株曲霉酸性蛋白酶活力均呈现逐渐升高的趋势，在36 h时，米曲霉A100-8酶活力已经远高于其他2株菌，米曲霉A酶活力又高于米曲霉沪酿3.042酶活力，且保持这一优势到制曲结束。米曲霉沪酿3.042在制曲36 h后酶活力出现下降的趋势，但在42 h后又有增加趋势，应选择在酶活力较高的情况下进行收曲，大致时间为40 h左右。此时米曲霉A100-8酶活力为1600 U/g左右；米曲霉A为1300 U/g左右；米曲霉沪酿3.042为660 U/g左右。

2.2 淀粉酶活

(1)支模前，应根据构件尺寸进行模板设计，对模板支撑体系进行设计与验算，保证模板具有足够的强度和刚度。

淀粉酶在酱油酿造生产的过程中起到分解淀粉质原料的作用。生成还原糖、糊精等成分，为微生物进行酒精发酵、有机酸发酵提供底物，并增加酱油中固形物的含量。1 g干重大曲中的淀粉酶在40 ℃，5 min内水解1 mg淀粉量定义为1个淀粉酶活力单位。

图2 淀粉酶活力的变化Fig.2 The change of amylase activity

由图2可知，在制曲24～36 h内，米曲霉A和米曲霉沪酿3.042酶活力均呈缓慢增长的趋势，而米曲霉A100-8酶活力呈先升高后降低的趋势。在制曲36～42 h内，3株曲霉的酶活力均大幅增加。40 h后米曲霉A100-8酶活力逐渐下降，米曲霉沪酿3.042酶活力也增加缓慢。因此，将收曲时间定为42 h左右较为恰当。此时米曲霉A100-8酶活力最高，为1115.13 U/g；米曲霉沪酿3.042次之，为1034.48 U/g；米曲霉A最弱，为954.91 U/g。

2.3 糖化酶活

酱油生产中糖的代谢水平或产生能力更多地体现在促进微生物的醇代谢、酯代谢等代谢活动，进而表现在产品的芳香性组分的变化上。糖化酶等活力的增加可以增加酱醪中的碳源，加强酵母的碳代谢强度，从而增加芳香物质的产生，增加总酯的含量。在40 ℃，pH 4.6条件下，每1 h水解淀粉产生1 mg葡萄糖作为1个酶活力单位。

图3 糖化酶活力的变化Fig.3 The change of saccharifying enzyme

由图3可知，在制曲24～48 h之间，3株菌的糖化酶酶活力呈逐渐上升的趋势。并且大体上米曲霉沪酿3.042酶活力最高，米曲霉A100-8酶活力次之，米曲霉A酶活力最弱。在制曲48 h时3株曲霉酶活力均达到最高值。其中米曲霉沪酿3.042酶活力最高，为1935.5107 U/g；米曲霉A100-8次之，为1708.1099 U/g；米曲霉A最弱，为1565.7674 U/g。

2.4 纤维素酶活

纤维素酶作用于植物细胞外壁，使其分解，从而促进蛋白质等内溶物质的溶解，进而促进其他酶的作用效果，提高原料利用率，改善酱油的品质。纤维素酶活过低，会导致氨基态氮水平低的情况，但纤维素酶活力过高不利于之后的淋油，也应对此注意。纤维素、半纤维素水解后释放大量的糖类，包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖等，其中六碳糖易经微生物酵解生成乙醇。酵母在无氧条件下，经糖酵解途径将葡萄糖分解产生丙酮酸，再在脱羧酶的作用下脱羧生成乙醛，在乙醇脱氢酶作用下将乙醛还原成乙醇，因此纤维素酶活力高还可以提高醇类的生成量。纤维素水解羧基纤维素分子中β-1,4-葡萄糖苷键，释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应，产生颜色变化，这种颜色的变化与释放还原糖的量成正比，即与酶活性成正比。通过对应标准曲线(以葡萄糖为标准)可以确定还原糖的含量，从而确定酶的活力单位。1 g干重大曲在40 ℃，pH 4.8条件下，1 h水解CMC产生相当于1 mg葡萄糖的还原糖定义为1个纤维素酶活力单位。

图4 纤维素酶活力的变化Fig.4 The change of cellulase activity

由图4可知，在制曲24～36 h期间，3株曲霉酶活力均呈明显上升趋势。在制曲36 h后，米曲霉A酶活力出现下降，其他2株曲霉酶活力依然增加，但纤维素酶活力过高并不利于之后的淋油过程，当其满足需要量300 U/g曲即可，因此在40 h左右进行收曲较为合适。此时米曲霉A100-8酶活力较高，为310 U/g左右；米曲霉A紧随其后，为280 U/g左右；米曲霉沪酿3.042较弱，为240 U/g左右。3株曲霉此时的纤维素酶活可以保证既能充分水解植物原料中的纤维素，提高原料的利用率，又能保证之后的淋油过程顺利进行。

果胶酶是分解植物主要成分——果胶质的酶类，其起到改善酱醪粘度和过滤性、增强酱油体态的作用，但在曲霉分泌该酶的过程中，其表达水平逐渐降低，有报道认为该酶产生过量不利于后期淋油。果胶酶对果胶质有酯解、裂解、水解的作用，能够作用于α-1,4-糖苷键，水解得到D-半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸等物质，它们都含有一定量的醛基，有还原性，与DNS共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的含量与反应液的颜色强度成正比。在pH 4.4，45 ℃水浴条件下，每1 min水解果胶质产生1 μmol半乳糖醛酸所需的酶量为1个果胶酶活力单位。

图5 果胶酶活力的变化Fig.5 The change of pectinase activity

由图5可知，在制曲24～30 h内，米曲霉沪酿3.042与米曲霉A100-8 2株曲霉果胶酶活力呈上升趋势，米曲霉A呈降低趋势。30～36 h内，3株曲霉酶活力均呈下降趋势，但36 h后3株曲霉酶活力逐渐上升，除米曲霉A100-8在制曲42 h后酶活力出现小幅下降的情况。由于果胶酶活力过高同样不利于之后的淋油，当其满足需要量250 U/g曲即可。因此在制曲42 h左右进行收曲，此时米曲霉沪酿3.042酶活力最高，为252.5 U/g；米曲霉A100-8次之，为241.8 U/g；米曲霉A最弱，为233.8 U/g。该收曲时间可保证酶的作用充分发挥。

2.6 氨肽酶活

氨肽酶是外肽酶中的一个类别，它从肽链氨基末端逐个催化水解相应的疏水性氨基酸，其中有些不但能水解多肽，甚至具有催化水解完整蛋白质分子的能力。当蛋白质大分子被酶解时，肽链中的疏水性氨基酸处在肽链末端暴露在外面，接触味蕾后产生苦味。在酱油酿造的过程中氨肽酶可以大幅提高蛋白质利用率，节省成本，还可提高氨基酸生成率，进而提高产品的鲜、香味，并为酱油着色做出贡献。

图6 亮氨酸氨肽酶活力的变化Fig.6 The change of leucine aminopeptidase activity

由图6可知，在制曲24～48 h间3株曲霉酶活力均在逐渐升高，成熟大曲对亮氨酸氨肽酶的需要量为30 U/g曲，在制曲36 h时，可以达到该标准，此时米曲霉沪酿3.042酶活力最高，为36.1658 U/g；米曲霉A100-8次之，为30.3304 U/g；米曲霉A较弱，为29.1423 U/g。

2.7 谷氨酰胺酶活

谷氨酰胺酶是影响发酵食品风味的一种关键酶，它能够分解酱油中以谷氨酰胺形式存在的谷氨酸，生成鲜味的谷氨酸和氨。米曲霉和酱油曲霉所制成的酱油曲的浸出液，谷氨酰胺酶的作用最适pH为6.5～7.5，最适温度为40～45 ℃。在制醪发酵的初期，借助曲霉蛋白酶的作用，原料中的谷氨酸及谷氨酰胺溶出。谷氨酰胺性质不稳定，高温或酸性条件(pH 4.5)下易变为无味的焦性谷氨酸，在酶的作用下才能变为谷氨酸。因此必须选择具有高活力的肽酶，特别是亮氨酸氨肽酶及高活性谷氨酰胺酶的酱油曲进行后续的发酵。

图7 谷氨酰胺酶活力的变化Fig.7 The change of glutaminase activity

由图7可知，3株曲霉在制曲过程中谷氨酰胺酶活力在24～42 h均呈上升趋势，此时曲的温度与pH均适宜积累谷氨酰胺酶。在制曲42 h之后酶活力均开始大幅下降，此时孢子成熟多，消耗曲料碳水化合物等原料，曲料pH略有下降，曲料水分活度下降，呼吸产热。因此在制曲42 h时收曲较为合适，此时米曲霉A100-8酶活力较高，为3.427 U/g；米曲霉沪酿3.042次之，为3.182 U/g；米曲霉A稍弱，为2.938 U/g。基本上能够达到需要量3.3 U/g曲的要求。

2.8 植酸酶活

植酸可以与蛋白质络合影响蛋白质的利用，植酸酶可以将植物原料中的植酸及其盐分解为肌醇和磷酸，增加了可利用磷的含量，并降低植酸对矿物质和蛋白质的结合力，从而增加矿物元素的营养效价和蛋白质利用率。此外还能够在酱油发酵过程中分解呈味性的核酸类物质，改善酱油的滋味。

图8 植酸酶活力的变化Fig.8 The change of phytase activity

由图8可知，3株曲霉在制曲24～36 h植酸酶活力上升迅速，36 h后开始缓慢下降。最终3株曲霉所制备的大曲酶活力差别不大，基本稳定在9 U/g曲。在制曲42 h时，米曲霉沪酿3.042酶活力最高，为9.522 U/g；米曲霉A次之，为9.441 U/g；米曲霉A100-8最弱，为8.951 U/g。

3 结论

制曲是酱油发酵至关重要的步骤，直接影响蛋白利用率等经济指标。因此本文首先研究了米曲霉A、米曲霉沪酿3.042、米曲霉A100-8在制曲24，30，36，42，48 h时8种酶活力情况，包括酸性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶、亮氨酸氨肽酶、谷氨酰胺酶、植酸酶。研究发现：3株曲霉酸性蛋白酶活力在制曲40 h左右可达到最佳值，此时米曲霉A100-8酶活力最高，为1600 U/g。另外，3株曲霉的淀粉酶、谷氨酰胺酶的酶活力在制曲42 h也达到最大值，且米曲霉A100-8活力最高。纤维素酶活力在制曲40 h时可达到最佳酶活力值，且米曲霉A100-8活力最高。亮氨酸氨肽酶活力在制曲36 h即可达到需要量，米曲霉沪酿3.042活力最高。果胶酶和植酸酶活力在制曲42 h可达到最佳酶活力值，米曲霉沪酿3.042活力最高。糖化酶活力在制曲48 h时达到最大值，且米曲霉沪酿3.042活力最高。综合上述8种酶的活力情况，确定收曲时间为42 h，此时米曲霉A100-8大多数酶酶活力相对优势较明显。

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ComparisonoftheEnzymeActivityofAspergillusoryzaeFermentedbyThreeKindsofSoySauce

TAN Yong-shui1, GUO Lin2, LIU Xin-li1*, HOU Li-hua2

(1.College of Biological Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353, China;2.New Village Development Research Institute, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Koji making is very important for soy sauce brewing, which affects the quality of soy sauce. In this paper, the enzyme activities ofAspergillusoryzaeA,Aspergillusoryzae3.042,AspergillusoryzaeA100-8 at different koji-making time of soy sauce fermentation are studied. They are acid protease, amylase, saccharifying enzyme, cellulase, pectinase, leucine aminopeptidase, glutamine enzyme and phytase. Combined with the change of enzyme activity,hydrolysis degree and later brewing pour oil, 42 h is determined for ripe koji of three kinds ofAspergillusoryzae. It is found that the enzyme activity ofAspergillusoryzaeA100-8 is the best when the koji is collected.

koji making of soy sauce；AspergillusoryzaeA；AspergillusoryzaeA100-8；Aspergillusoryzae3.042；enzyme activity

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.005

1000-9973(2017)11-0024-05

2017-05-15 *通讯作者

大学生创新训练项目(201610431015)

谭永水(1990-)，男，山东潍坊人，硕士，研究方向：微生物工程。