莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)固液双相发酵配方研究

李姝江，彭娇洋，朱涵明月，刘 倩，王诗玮，朱天辉*，黄祖惠，吴继云，张 霞

(1.四川农业大学林学院，四川 成都 611130；2.大邑县农林局，四川 成都 611330)

莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)固液双相发酵配方研究

李姝江1，彭娇洋1，朱涵明月1，刘 倩1，王诗玮1，朱天辉1*，黄祖惠2，吴继云2，张 霞2

(1.四川农业大学林学院，四川 成都 611130；2.大邑县农林局，四川 成都 611330)

莱氏野村菌(Nomuraearileyi)通过基础培养基基质、碳、氮、维生素筛选，玉米(50 g)、葡萄糖(1.5 g)、水解酪蛋白(1.5 g)、抗坏血酸(0.5 mg)、水50 mL为最佳固体培养基质(培养10 d)，产孢量达4.78×1010cfu·mL-1。以SMY为液体培养基质，莱氏野村菌最适发酵条件：1.0×108cfu·mL-1接种浓度，25℃、pH=6、全天光照、180 r·min-1振荡培养7 d，菌丝干重为690.2 mg。固体发酵为复合粉炮生产提供基础配方，液体发酵缩短时间后可作为固体培养生产莱氏野村菌菌粉的二级种子，发酵产品为杜仲梦尼夜蛾粉炮防治重要生物制剂。

莱氏野村菌；发酵；培养基；杜仲梦尼夜蛾

莱氏野村菌Nomuraearileyi(Farlow) Samsonn于1883年被首次报道，Farlow研究了该菌并依照其孢子梗形态命名，称其为莱氏葡萄孢(BotrytisrileyiFarlow)[1,2]。1974年Kish等[3]人正式对其命名为莱氏野村菌(Nomuraearileyi)，并将其作为野村菌属的模式种，得到人们的普遍认可而沿用至今。莱氏野村菌侵入寄主昆虫的病理过程包括：寄主识别、机械破坏、营养竞争、代谢干扰、毒素分泌及寄主组织结构破坏等几个部分，是一个非常复杂的双向生理生化过程[4]。该菌曾在人工条件下成功引起大豆田夜蛾流行病，在国外已经广泛应用于田间夜蛾科害虫的防治[5,6]。陆续又有将莱氏野村菌用于高粱棉铃虫[7,8]、苜蓿绿夜蛾[9]等的防治。我国在1996年首次报道使用莱氏野村菌孢子悬浮液在田间控制棉铃虫，虫口密度显著下降[10]。

国外的发酵工艺多采用液体深层发酵，我国除液体发酵之外，还探索出一套通过固体浅层发酵方式进行大规模开放式生产的工艺[11]。通过发酵技术研究各类微生物产物的发酵规律并加以利用，改进工艺水平并提高生产效率，大幅提升生物农药的产量、质量将不再是难题。发酵参数对微生物菌丝生长量和产孢量都有极大影响，大多数虫生真菌在25℃[12]下生长最好，菌丝生长量和分生孢子产量最高的pH与自然pH相近[13]，培养基中碳氮源种类的选择可以显著促进虫生真菌微循环产孢[14]，孔琼等[15]研究维生素在莱氏野村菌生长中的作用，发现对其菌落产孢有明显的促进作用的维生素有生物素、烟酸和抗坏血酸3种。国内关于杜仲梦尼夜蛾取食杜仲叶片导致经济林损失惨重的报道屡见不鲜，但有效的无公害防治方法尚少。前期试验证明，莱氏野村菌对杜仲梦尼夜蛾有明显控制作用，因此，相关发酵条件优化为该菌投入生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：莱氏野村菌(Nomuraearileyi)由四川农业大学林学院森林保护实验室提供，分离于大邑县杜仲种植基地罹病的梦尼夜蛾虫尸。

培养基质：高粱、大米、大豆、玉米、小麦、各种碳、氮源、SMY 培养基(麦芽糖 4%，蛋白胨 1%，酵母粉 1%)。

仪器与设备：高压灭菌锅、超净工作台、振荡培养箱、恒温培养箱、电子天平、血球计数板。

菌种活化：采用PPDA培养基(1 L PDA中添加蛋白胨10 g)进行扩繁。25℃下培养10 d，备用。

菌悬液的制备：用灭菌的0.05%Tween-80洗脱PPDA斜面上生长的分生孢子，将洗脱液置于漩涡振荡器内充分振荡均匀，经血球计数板测定孢子浓度。

1.2 莱氏野村菌的固体发酵培养

1.2.1 基础培养基质筛选

为探索适宜生产莱氏野村菌分生孢子的培养基及培养条件，在前人的研究基础上，利用单因素试验对大豆、小麦、高粱、大米等材料进行筛选，并优化发酵条件。

高粱、大米、大豆、玉米、小麦各取50 g，加50 mL水分别煮沸，湿度为手握基质时掌心有水印而无水滴出，用三角瓶分装。高压灭菌后接种上述液体发酵孢子悬浮液，接种3.63×108cfu·mL-1的孢子悬浮液20 mL，置于25℃下光照培养10 d后取出，计算其孢子含量。每个基质设置5个重复。

1.2.2 不同碳源对莱氏野村菌生长的影响

在上述试验筛选出的最佳培养基质(50 g)中分别添加 1.5 g(50 mL溶解)的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、木糖、甘露醇和可溶性淀粉，配制成含不同碳源的培养基，以无碳源的基础培养基为对照，配制成含不同碳源的培养基，研究不同碳源对莱氏野村菌生长的影响，接种3.63×108cfu·mL-1的孢子悬浮液20 mL，之后置于25℃下光照培养10 d后取出，计算其孢子含量。每组试验重复5次，试验结果为5次重复的平均值。

1.2.3 不同氮源对莱氏野村菌生长的影响

在上述试验筛选出的最佳培养基质(50 g)中分别添加 1.5 g(50 mL溶解)的酵母浸粉、尿素、牛肉蛋白胨、硝酸钠、硝酸钾、水解酪蛋白、胰蛋白胨和硝酸铵，将他们作为生长所需的氮源，以无氮源的基础培养基为对照，配制成含不同氮源的培养基，研究不同氮源对莱氏野村菌生长的影响，接种3.63×108cfu·mL-1的孢子悬浮液20 mL，之后置于25℃下光照培养10 d后取出，计算其孢子含量。每组试验重复5次，试验结果为5次重复的平均值。

1.2.4 不同维生素对莱氏野村菌生长的影响

在上述试验筛选出的最佳培养基质(50 g)中，分别加入0.5 mg(50 mL溶解)的抗坏血酸、硫胺素、吡哆醇、核黄素、生物素，以不加任何维生素的基础培养基作为对照，配制成含不同维生素的培养基，研究不同维生素对莱氏野村菌生长的影响，接种3.63×108cfu·mL-1的孢子悬浮液20 mL，之后置于25℃下光照培养10 d后取出，计算其孢子含量。每组试验重复5次，试验结果为5次重复的平均值。

单因素试验选出的最适因子进行配比同上述试验条件测定其产孢量。

1.3 莱氏野村菌的液体发酵参数筛选

1.3.1 pH对菌丝干重的影响

将配备好的SMY培养基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高压灭菌后用NaOH和HCL将SMY液体培养基的pH分别调至4、5、6、7、8、9、10，之后分别接种1 mL菌悬液，接种浓度为1.0×l07cfu·mL-1，放在培养温度为28℃的震荡培养箱里摇床转速为180 r·min-1每个处理3个重复。 7 d后，将培养好的发酵液过滤，把过滤后的菌丝放在60℃的烘箱里烘干2 h后称取菌丝干重。

1.3.2 接种浓度对菌丝干重的影响

将配备好的SMY培养基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高压灭菌后分别接种1 mL的菌悬液,接种浓度分别为1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108l、1.0×109cfu·mL-1。放在培养温度为28℃摇床转速为180 r·min-1的振荡培养箱里培养，培养基pH值为自然，每个处理3个重复。7 d后测处理后的菌丝干重。

1.3.3 摇床转速对菌丝干重的影响

将配备好的SMY培养基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，接种1 mL的菌悬液。接种浓度为1.0×108cfu·mL-1，转速设置分别为60 r·min-1、100 r·min-1、140 r·min-1、180 r·min-1、220 r·min-1，放在培养温度为28℃的振荡培养基里培养，培养基pH值为自然。每个处理3个重复，7 d后测处理后的菌丝干重。

1.3.4 温度对菌丝干重的影响

将配备好的SMY培养基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高压灭菌后，分别接种1 mL的菌悬液,接种浓度为1.0×108cfu·mL-1，振荡培养箱温度分别设置为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃，培养基pH值为自然，光照时间为12L/12D，每个处理3个重复，7 d后测发酵液的菌丝干重。

1.3.5 光照对菌丝干重的影响

将配备好的SMY培养基各150 mL放在250 mL的三角瓶中，高压灭菌后，分别接种1 mL的菌悬液，接种浓度为1.0×108cfu·mL-1，振荡培养箱培养温度为28℃，光照条件设置为0L(光照):24D(黑暗)、6L:18D、12L:12D、18L:6D、24L:0D，每个处理3个重复， 7 d后测发酵液的菌丝干重。

单因素试验选出的最佳条件进行配比在SMY培养基上测定其菌丝干重。

1.4 数据分析

固体发酵采用血球计数板对孢子进行计数，液体发酵称取菌丝干重，将所获得数据采用SPSS17.0软件进行数据分析检验差异显著性，EXCEL软件为辅助统计分析，用Duncan进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 固体发酵配方优化

2.1.1 不同固体基质对莱氏野村菌产孢量的影响

产孢量结果表明，以玉米作为固体基质产孢量最大，达到(16.40±2.76)×109cfu·mL-1，大米和高粱次之，大豆最低，除玉米外，其余基质产孢量差异不显著。玉米与其他基质间差异均达显著水平(P<0.05)(表1)，综合比较五种固体基质对莱氏野村菌产孢量的影响，选择玉米作为固体基质进一步研究。

表1 不同固体基质培养莱氏野村菌的产孢量

注：表中数据为平均数±SD，同列中不同字母表示差异显著(LSD，P<0.05)。

2.1.2 不同碳源对莱氏野村菌产孢量的影响

比较供试的几种碳源对菌落产孢量的影响(表2)，以葡萄糖为碳源的产孢量最大，达(17.60±1.65)×109cfu·mL-1；与其他糖类差异显著(P<0.05)；其次是麦芽糖，产孢量为(12.47±0.50)×109cfu·mL-1。余下几个碳源种类，蔗糖、果糖、可溶性淀粉、甘露醇、木糖与对照组差异不显著，其中可溶性淀粉、甘露醇、木糖相较于对照组，产孢量较低。

表2不同碳源固体培养基培养莱氏野村菌的产孢量

C源产孢量(×109cfu·mL-1)葡萄糖17.60±1.65a麦芽糖12.47±0.50b蔗糖11.73±5.50bc果糖11.47±3.67bc无添加(对照)8.23±0.06bc可溶性淀粉8.04±0.34bc甘露醇7.93±2.66c木糖6.95±0.30c

注：表中数据为平均数±SD，同列中不同字母表示差异显著(LSD，P<0.05)。

2.1.3 不同氮源对莱氏野村菌产孢量的影响

氮源对于莱氏野村菌的固体发酵培养产孢影响表明(表3)，与对照组相比，水解酪蛋白和胰蛋白胨对菌株的产胞有明显的促进作用，产孢量以水解酪蛋白最大，达(36.97±0.47)×109cfu·mL-1，胰蛋白胨次之，达(35.17±0.95)×109cfu·mL-1，两者差异并不显著，且均与其他氮源差异性显著(P<0.05)，余下氮源中，以硝酸钠、牛肉膏蛋白胨、酵母浸粉、硝酸铵与对照组无显著差异；硝酸钾与脲产孢量较对照组较差，有一定抑制作用，其中氮源为脲的固体培养基上，始终未见菌落形成。

表3不同氮源固体基质培养莱氏野村菌的产孢量

N源产孢量(×109cfu·mL-1)水解酪蛋白36.97±0.47a胰蛋白胨35.17±0.95a无添加(对照)14.13±5.61b硝酸钠13.80±2.59b牛肉膏蛋白胨13.77±2.05b酵母浸粉12.90±2.75bc硝酸铵11.37±2.55bc硝酸钾7.99±5.39c脲0.00±0.00d

注：表中数据为平均数±SD，同列中不同字母表示差异显著(LSD，P<0.05)。

2.1.4 不同维生素对莱氏野村菌产孢量的影响

实验结果(表4)显示，在培养基中分别添加6种维生素，对莱氏野村菌的产孢量，除了硫胺素对该菌的产孢有一定抑制作用外，其余维生素都对其有一定的促进作用，其中，以抗坏血酸对其促进作用最大，产孢量达(11.29±5.68)×109cfu·mL-1，但与对照组无显著差异。

表4不同维生素固体基质培养莱氏野村菌的产孢量

维生素产孢量(×109cfu·mL-1)抗坏血酸11.29±5.68a核黄素11.15±2.64a吡哆醇11.07±2.98a生物素10.52±3.55a无添加(对照)8.38±0.14a硫胺素6.72±2.13a

注：表中数据为平均数±SD，同列中不同字母表示差异显著(LSD，P<0.05)。

由此可见，玉米(50 g)、葡萄糖(1.5 g)、水解酪蛋白(1.5 g)、抗坏血酸(0.5 mg)、水50 mL为最佳固体培养基质(培养10 d)，产孢量达4.78×1010cfu·mL-1。

2.2 液体发酵参数优化

2.2.1 接种浓度对菌丝干重的影响

从表5可以看出接种的菌株悬液浓度在1.0×108cfu·mL-1时能够得到最多的菌丝干重，但是与浓度1.0×107与1.0×109得到的菌丝干重没有显著性差异，故后续选择浓度为1.0×108cfu·mL-1为最佳接种浓度继续后续研究。

表5 接种浓度对菌丝干重的影响

注：经Duncan多重比较，不同的大写字母代表在P<0.01水平差异极显著；不同的小写字母代表在P<0.05水平差异显著。

2.2.2 pH对菌丝干重的影响

从表6可以看出，pH对莱氏野村菌液体发酵菌丝干重影响很大，当pH=6时得到菌丝干重最大。pH 5和pH 7 时菌丝的干重差别不大，但是与前者差异显著，pH=4和9、10差异明显，由此可以看出， 适合菌种生长的pH在5～7之间，最佳的pH值为6。

表6 pH对菌丝干重的影响

注：经Duncan多重比较，不同的大写字母代表在P<0.01水平差异极显著；不同的小写字母代表在P<0.05水平差异显著。

2.2.3 摇床转速对菌丝干重的影响

摇床转速可影响液体菌种在发酵过程中氧气的供给。 表7可以看出转速对该菌株的产孢有明显影响，在低转速(60 r·min-1)时候菌丝生长比较缓慢,摇床在180 r·min-1时菌丝的产量最高，供氧量适宜。

表7 摇床转速对菌丝干重的影响

注：经Duncan多重比较，不同的大写字母代表在P<0.01水平差异极显著；不同的小写字母代表在P<0.05水平差异显著。

2.2.4 温度对菌丝干重的影响

温度是研究虫生真菌生长的重要因素之一。 在不同的温度条件下，菌株在液体发酵中菌丝干重情况不同。 从表8可以看出，菌株在10-30℃，温度过低或者过高，菌株的产孢有着明显的不同。25℃能得到菌丝干重最大，30℃时得到的菌丝干重最低，10℃明显没有菌丝产生，说明了温度是影响菌株液体发酵的很重要条件。

表8 温度对菌丝干重的影响

注：经Duncan多重比较，不同的大写字母代表在P<0.01水平差异极显著；不同的小写字母代表在P<0.05水平差异显著。

2.2.5 光照对菌株菌丝干重的影响

表9可以看出24D时菌丝干重最少，24L有较多的干物质积累，说明连续的光照促进菌丝生长。

表9 光照对菌丝干重的影响

注：经Duncan多重比较，不同的大写字母代表在P<0.01水平差异极显著；不同的小写字母代表在P<0.05水平差异显著。

综上，SMY培养基最适发酵条件：1.0×108cfu·mL-1接种浓度，25℃、pH=6、全光照、180 r·min-1振荡培养7 d，菌丝干重为690.2 mg。

3 结论与讨论

固体发酵配方优化试验结果表明：不同的固体培养基质以及不同营养种类对莱氏野村菌的产孢量影响明显。玉米为菌产孢的最佳固体培养基基质，与他人研究结果为大豆最好不同，可能与大豆的煮沸程度，豆子的种类等有关[16]；玉米粒来源广、价格相对便宜，是一种适于莱氏野村菌固体发酵的基质，但培养时间过长，工艺还有待提高。葡萄糖为该菌产孢的最佳碳源，其菌落产孢量最高；水解酪蛋白和胰蛋白胨为莱氏野村菌产孢的最佳氮源，所选维生素中，对莱氏野村菌产孢无显著影响，其中硫胺素较对照组产孢量偏低，有一定抑制作用。固体发酵为复合粉炮生产提供基础配方。

液体发酵参数试验结果表明：莱氏野村菌菌株在SMY培养基中，pH=6为菌丝生长的最适宜pH，振荡箱的转速在180 r·min-1时，融氧适宜，培养温度在25℃，光照设置为全天光照能促进菌丝干物质积累；在实际生产发酵中，接种菌悬液的浓度可控制在1.0×108cfu·mL-1左右。液体发酵主要采取先发酵生产后提取回收产物的工艺，在回收时采用离心浓缩等方式容易导致大量有效成分随滤液遗弃，提取物毒力水平有所降低，只能通过深层发酵提高质量，相应又延长了发酵时间，降低了发酵效率[17]。此外，我国目前的干燥设备较落后，回收效率及回收质量都不理想。想要打破这种恶性循环，还有待进一步优化发酵参数，或开发新设备辅助提高液体发酵的效率。结合来看，本研究液体发酵缩短时间后可作为固体培养生产莱氏野村菌菌粉的二级种子。

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OptimizationofSolid-liquidBiphasicFermentConstitutionofNomuraearileyi

LI Shu-jiang1PENG Jiao-yang1ZHU Hanmingyue1LIU Qian1WANG Shi-wei1ZHU Tian-hui1*HUANG Zu-hui2WU Ji-yun2ZHANG Xia2

(1.College of Forestry,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China；2.Dayi County Bureau of Agriculture and Forestry,Chengdu 611330,China)

Screening by substrates of basic medium,C,N,and vitamin,the formula of corn(50 g),glucose(1.5 g),casamino acids(1.5 g),ascorbic acid(0.5 mg),H2O(50 mL) was optimal medium substrates(cultivation for 10 d) forNomuraearileyi,the sporulation quantity was 4.78×1010cfu·mL-1.Taking SMY as the liquid medium,the optimal fermentation conditions ofN.rileyiwere as below:1.0×108cfu·mL-1of inoculated concentration,25 ℃,pH6,full light,180 r·min-1of shaking culturing for 7 days,and 690.2 mg of mycelia.The solid fermentation provided the basic formula for producing compound powder,and shortened time of liquid fermentation could be used as secondary generation for producingN.rileyipowder of solid fermentation.The fermented product is the important biological preparation of controlOrthosiasongi.

Nomuraearileyi,Fermentation,Medium,Orthosiasongi

2017-07-03

李姝江(1983-)，博士，副教授，硕士生导师，主要从事林木病虫害及其防治方面的研究。

朱天辉(1963-)，博士，教授，博士生导师，主要从事林木病虫害及其防治方面的研究。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.05.007

S763.3

A

1003-5508(2017)05-0033-05