丹参饮对两种血瘀模型大鼠红细胞膜组分的影响

牛雯颖，李诗畅，袁茵，邓思瑶，黄雅晨，肖洪彬

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

实验研究

丹参饮对两种血瘀模型大鼠红细胞膜组分的影响

牛雯颖，李诗畅，袁茵，邓思瑶，黄雅晨，肖洪彬*

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：观察丹参饮对两种血瘀模型大鼠的作用，从红细胞膜组分入手探讨其改善血瘀证的作用机理。方法：寒凝血瘀实验选取Wistar大鼠，随机分为空白组、寒凝血瘀模型组、丹参饮高、低剂量组，每组10只。除空白组外，其他各组复制寒凝血瘀模型，给药组每日给药1次，连续造模14 d。第15 d大鼠皮下注射盐酸肾上腺素2次，间隔4 h，两次之间冰水浴浸泡5 min，末次造模后禁食不禁水12 h。气虚血瘀实验选取Wistar大鼠，随机分为空白组、气虚血瘀模型组、丹参饮高、低剂量组，每组10只。除空白组外，其他组复制气虚血瘀模型，造模14 d。各组每天灌胃给药，连续15 d。取血测定血液流变学及红细胞膜组分相关指标。结果：对于寒凝血瘀模型组，丹参饮能够显著降低全血黏度(P<0.01)，升高红细胞变形指数(P<0.01)，显著升高巯基、唾液酸含量和SOD活力(P<0.05)。丹参饮具有显著降低气虚血瘀模型组低切全血黏度、血浆黏度的作用(P<0.05，P<0.01)，对红细胞变形指数、Na+-K+-ATP酶活力具有升高作用(P<0.05，P<0.01),并可升高唾液酸、巯基含量(P<0.01，P<0.05)，显著降低MDA及膜胆固醇含量(P<0.05)。结论：丹参饮可能是通过增加抗氧化性，减轻自由基对红细胞攻击程度，增加唾液酸含量从而增加红细胞膜表面负电荷，降低红细胞聚集性达到改善寒凝血瘀模型大鼠血液高凝状态。此外，可能通过提高Na+-K+-ATP酶活力、膜胆固醇含量以及降低MDA含量，改善红细胞的变形性，从而达到改善气虚血瘀模型大鼠血瘀状态。

丹参饮；寒凝血瘀；气虚血瘀；血液流变学；红细胞膜

丹参饮出自陈修园《时方歌括》，书中有云：“心腹诸痛有妙方，丹参为主义当详，檀砂佐使皆遵法，入咽咸知效验彰”，该方“治心痛、胃脘诸痛多效”[1]。 丹参饮仅丹参、砂仁、檀香三味药组成，现代药理研究证明丹参饮对血小板有明显的抑制作用[2]。临床多加味应用，对慢性萎缩性胃炎、胸痹、胃痛均具有良好的疗效[3]。本实验采用寒凝血瘀和气虚血瘀两种血瘀模型，从不同角度探讨丹参饮对于两种血瘀模型的作用机理，为血瘀证的治疗提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级雄性Wistar老龄大鼠80只，雌雄各半，体质量(265±19)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(动物合格证号SCXK(黑)2008004)。

1.2 药物

丹参饮由丹参30 g、檀香5 g、砂仁5 g组成，药液煎煮2次，具体参见文献[4]。

1.3 仪器

LBY-N75B型血液黏度仪(北京普利生仪器有限公司)；LBY-BX型红细胞变形仪(北京普利生仪器有限公司)；Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；蒸发光散射检测器ELSD 2000(美国Alltech公司)；BECKMAN低温超速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；TGL-16G型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)。

1.4 试剂

甲醇(色谱纯，美国迪马技术有限公司)；甲醇(分析纯，西陇化工股份有限公司)；氯仿(分析纯，天津市化学试剂六厂分厂)；胆固醇对照品(美国Sigma公司)；Na+-K+-ATP酶、巯基、唾液酸、SOD及MDA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型制备及给药

2.1.1 寒凝血瘀模型制备及给药

造模方法见参考文献[4]。40只大鼠按体质量随机分为4组，即丹参饮高剂量组、低剂量组、寒凝血瘀模型组和空白组。每天给药1次，连续给药15 d。

2.1.2 气虚血瘀模型制备及给药

气虚血瘀模型制备方法见参考文献[5]。40只大鼠按体质量随机分为4组，即丹参饮高剂量组、低剂量组、气虚血瘀模型组和空白组。每天给药1次，连续给药15 d。

2.2 红细胞膜的制备及指标测定

红细胞膜的制备方法参见本课题组前期研究成果[3-6]。LBY-N75B型血液黏度仪测定全血黏度；LBY-BX型红细胞变形仪测定红细胞变形性；红细胞膜胆固醇含量、Na+-K+-ATP酶活性、唾液酸及巯基含量及SOD及MDA水平检测严格按照试剂盒说明书进行。

2.3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件处理所得数据，选用One-way ANOVA进行统计分析，数据以表示,以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血液流变学相关指标的变化

丹参饮具有显著降低寒凝血瘀模型大鼠全血黏度的作用，并能升高红细胞变形指数(P<0.05)，结果见表1；与气虚血瘀模型组大鼠比较，丹参饮能够显著降低全血黏度和血浆黏度(P<0.05，P<0.01)，升高红细胞变形指数(P<0.05)，结果见表2。

表1 丹参饮对寒凝血瘀模型大鼠血液流变学的影响

注：与寒凝组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表2 丹参饮对气虚血瘀模型大鼠血液流变学的影响

注：与气虚组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 寒凝血瘀模型大鼠红细胞膜组分变化

与空白组比较，寒凝血瘀组Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量及SOD活力均显著降低(P<0.05,P<0.01)，膜胆固醇含量升高显著(P<0.05)；与寒凝血瘀组相比，丹参饮高剂量组可显著升高巯基、唾液酸含量并提高SOD活力(P<0.05)，低剂量组对于唾液酸含量可显著升高(P<0.05)。结果见表3。

3.3 气虚血瘀模型大鼠红细胞膜组分变化

气虚血瘀模型组大鼠巯基、唾液酸含量以及Na+-K+-ATP酶活力与空白组比较均显著降低(P<0.05，P<0.01)，MDA含量和膜胆固醇含量均显著升高(P<0.05)；丹参饮可显著升高模型组巯基、唾液酸含量以及钠钾ATP酶活力(P<0.05，P<0.01)，显著降低MDA含量和膜胆固醇含量(P<0.05)。结果见表4。

4 讨论

丹参饮中君药丹参的现代药理研究较多，其主要成分丹参酮具有降低血黏度、抗凝、抗血栓、抗血小板黏附、改善微循环、抗氧化等多种药理学活性。能够促纤维蛋白溶解、改善微循环、缓解心肌缺氧缺血、缩小心肌梗死范围[6-11]。

表3 丹参饮对寒凝血瘀模型大鼠红细胞膜各成分的变化

注：与寒凝组比较，*P<0.05;与空白组比较，△P<0.05,▲P<0.01。

表4 丹参饮对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜各成分的变化

注：与气虚组比较，*P<0.05，**P<0.01;与空白组比较，△P<0.05,▲P<0.01。

对于寒凝血瘀模型大鼠，丹参饮可显著降低全血黏度，升高红细胞变形指数，在红细胞膜分子水平上增加了唾液酸和巯基含量以及SOD活力。唾液酸携带负电荷，能有效防止红细胞聚集[12]。巯基是一种膜蛋白，存在于细胞膜表面，具有保护细胞膜免遭过氧化损伤的作用。红细胞膜蛋白巯基的氧化还原对红细胞膜的粘弹性具有重要的影响，巯基氧化后构象发生改变导致膜粘弹性增加，变形性改变[13]。丹参饮可增加巯基含量和SOD活性，都起到清除自由基，抗氧化的作用。由上述结果我们推断，丹参饮可能是通过增加抗氧化性，使红细胞受自由基攻击程度减少，并且唾液酸含量的增加能够抑制红细胞聚集，达到改善寒凝血瘀模型大鼠血液高凝状态。

对于气虚血瘀模型大鼠，丹参饮可使全血黏度和血浆黏度显著降低，红细胞变形指数升高，在红细胞膜分子水平上可升高Na+-K+-ATP酶活力、巯基和唾液酸的含量，降低MDA和膜胆固醇含量。Na+-K+-ATP酶活性降低，红细胞内K+、Na+发生变化，使红细胞增大导致破裂。丹参饮对于巯基含量的增加和MDA含量的降低都有一定效果，可达到清除自由基，抗氧化的作用。由此我们推断丹参饮可能是通过提升钠钾泵活力、改变巯基和唾液酸含量，使得红细胞抵抗自由基的攻击程度有所提升，红细胞变形性有所改善，最终对气虚血瘀模型大鼠有明显改善作用。

[1] 白刚,肖洪彬.中药方剂研究与应用大全[M].北京:中国科学技术出版社,1995:123.

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[3] 牛雯颖,张玉昆,武爽,等.寒凝血瘀模型大鼠红细胞膜生物学研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(12):204-206.

[4] 牛雯颖,卞敬琦,冯月男,等.三首活血化瘀方对气虚血瘀模型大鼠红细胞膜蛋白组成影响的研究[J].上海中医药杂志,2014,48(11):87-90.

[5] 牛雯颖,武爽,张禹,等.气虚血瘀模型大鼠红细胞膜生物学研究[J].中医药信息,2013,30(4):120-122.

[6] 牛雯颖,袁良杰,韩翠翠,等.丹参注射液对老龄大鼠血液流变学指标和红细胞膜胆固醇的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2011,17(7):140-143.

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[10] 康广盛,李然,刘立萍.丹参饮对气滞血瘀型大鼠血液流变性的影响[J].中医药信息,2004,21(6):29-30.

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[12] 王云起,李国有,等.人红细胞老化过程中膜表面唾液酸变化的免疫AFM研究[J].电子显微学报,2007,26(1):60-63.

[13] 王翔,宋关斌,吴泽志,等.膜蛋白巯基的氧化还原修饰对红细胞膜粘弹性的影响[J].生物物理学报,1997,13(1):144-147.

TheEffectofDanshenYinontheComponentsofErythrocyteMembraneinTwoKindsofBloodStasisRats

NIU Wen-ying, LI Shi-chang, YUAN Yin, DENG Si-yao, HUANG Ya-chen, XIAO Hong-bin*

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To investigate the action mechanism of Danshen Yin(DSY) for two kinds of blood stasis rats. The components of erythrocyte membrane were studied. Methods:Wistar rats were selected by the cold stagnation and blood stasis experiment, they were randomly assigned to the blank group, the model group, the DSY high-dose group, and the DSY low-dose group, with 10 rats in each group. These rats were put into ice water (0℃～1℃) every day for 8-10 minutes until the rats were frozen. The DSY was given at the same time for 14 days. On the 15thday, adrenalin hydrochloride was injected into rats for twice with 4 h interval. In blood stasis due to qi deficiency experiment, the Wistar rats were randomly assigned to the blank group, the model group, the DSY high-dose group, and the DSY low-dose group, with 10 rats in each group. These rats were made into qi deficiency and blood stasis model. The DSY was given every day for 14 days. The related indexes of hemorheology and the components of erythrocyte membrane were determined. Results: Compared to the cold stagnation and blood stasis model group, the whole blood viscosity was decreased(P<0.01), and the red blood cell deformability were increased (P<0.01) by DSY. The contents of sialic acid, hydrosulphonyl and SOD in erythrocyte membrane were increased by DSY(P<0.05). Compared to the blood stasis due to qi deficiency model group, DSY could decrease the whole blood viscosity and plasma viscosity (P<0.05,P<0.01) and increase the red blood cell deformability (P<0.05). The contents of sialic acid, hydrosulphonyl and Na+-K+-ATP in erythrocyte membrane were decreased(P<0.05,P<0.01), and the contents of MDA and CHO in erythrocyte membrane were decreased (P<0.05) by DSY. Conclusion: DSY could improve the cold stagnation and blood stasis by reducing the free radical damage on red blood cell and by increasing the contents of sialic acid to decrease aggregation of red blood cells. Therefore, the hypercoagulable state of rats with cold stagnation and blood stasis were improved. In addition, DSY could improve qi deficiency and blood stasis by increasing the enzyme activity of Na+-K+-ATP and the content of membrane cholesterolsialic, and by decreasing the content of MDA to improve the deformability of red blood cells.

Danshen Yin; Cold stagnation and blood stasis; Qi deficiency and blood stasis; Hemorheology; Erythrocyte membrane

R285.5

A

1002-2406(2017)06-0019-04

国家自然科学基金项目(No. 81473555)；黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划(UNPYSCT-2016077)；黑龙江省博士后科研启动金资助项目(No. LBH-Q16213)；国家自然科学基金青年科学基金项目(No.81703981)

牛雯颖(1982-)，女，副研究员，主要从事中药药理学研究工作。

肖洪彬*(1957-)，男，教授，博士研究生导师，主要从事中药药理学研究工作。

2016-10-12

修回日期：2016-11-05