海南和四川不同生长年限曼地亚红豆杉3种紫杉烷类活性成分的比较研究

刘建慧，马生军，马留纯，曹雪琴，梁朔，吕苗，王颖,，王万勇，罗建民

(1.浙江丽水市农业科学研究院，浙江 丽水 323000；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；3.新疆分析测试中心，新疆 乌鲁木齐 830011;4.澄迈兴达田园农业有限公司，海南 澄迈 571900)

海南和四川不同生长年限曼地亚红豆杉3种紫杉烷类活性成分的比较研究

刘建慧1，马生军2*，马留纯2，曹雪琴3，梁朔1，吕苗2，王颖2,4，王万勇4，罗建民3

(1.浙江丽水市农业科学研究院，浙江 丽水 323000；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；3.新疆分析测试中心，新疆 乌鲁木齐 830011;4.澄迈兴达田园农业有限公司，海南 澄迈 571900)

目的：分析和比较海南和四川不同生长年限曼地亚红豆杉3种紫杉烷类活性成分的的含量差异。方法：利用甲醇和CHCl3混合液超声浸提后再用甲醇溶解得到相关成分；通过高效液相色谱法对10-DAB Ⅲ、三尖杉宁碱和紫杉醇含量进行测定和比较。结果：1)不同生长年限，海南栽培曼地亚红豆杉3年生枝条中10-DAB Ⅲ和紫杉醇含量均最高，7年生枝条中三尖杉宁碱含量最高；四川栽培曼地亚红豆杉4年生枝条中10-DAB Ⅲ和三尖杉宁碱含量均最高，紫杉醇含量在不同生长年限间不存在显著性差异(P>0.05)。2)相同生长年限，四川栽培曼地亚红豆杉10-DAB Ⅲ含量普遍高于海南栽培曼地亚红豆杉，三尖杉宁碱含量两个产地间有高有低，海南栽培3年生曼地亚红豆杉紫杉醇含量在所有年限间最高。结论：四川栽培曼地亚红豆杉10-DAB Ⅲ含量高于海南栽培曼地亚红豆杉，可以优先作为10-DAB Ⅲ提取的材料来源产地；海南栽培4年生和3年生曼地亚红豆杉分别作为三尖杉宁碱和紫杉醇粗提原料来源更优。

海南；四川；生长年限；曼地亚红豆杉；紫杉烷类

曼地亚红豆杉(TaxusmadiaRehd.)属红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)，是东北红豆杉(T.cuspidateSieb. et Zucc.)与欧洲红豆杉(T.baccataL.)的杂交种，20世纪末引入中国，相较同属其他种生长迅速且适应性强，不仅树皮中含有紫杉醇，而且枝叶中紫杉醇含量甚至有高达0.069%的报道，使其成为利用红豆杉树皮提取抗癌药物紫杉醇的最佳替代原料[1-3]。除紫杉醇外红豆杉枝叶提取物中还包含其他10余种亦具有抗癌活性的紫杉烷类化合物，如10-脱乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl-bacratin Ⅲ，10-DAB Ⅲ)、三尖杉宁碱(cephalomannine)等[4-5]。药理实验表明10-DAB Ⅲ和三尖杉宁碱也具有较强的抗肿瘤活性，10-DAB Ⅲ是紫杉醇半合成的重要前体物之一，还可利用其合成多烯他塞(docetaxel)，后者比紫杉醇具有更高的抗氧化活性；而三尖杉宁碱与紫杉醇结构十分相近，可转化为紫杉醇或开发成新的抗肿瘤药物[4]。

环境及人为因素对植物的生长和活性成分含量的影响较为显著[6]。因此，对在不同生态地区引种红豆杉并进行有效成分含量比较具有重要意义，可为红豆杉栽培品种的科学选择与进一步生态条件的优化提供依据。目前，有关不同采集时间、不同诱导子、不同栽培类型等对曼地亚红豆杉中紫杉醇含量影响的研究已有报道，而有关环境因子尤其是产地和生长年限对10-DAB Ⅲ和三尖杉宁碱含量影响的研究却鲜有报道[7-9]。本研究利用HPLC法对海南和四川不同栽培年限的曼地亚红豆杉样品进行检测，对比两个不同产区3种活性成分的差异，从而探讨环境因素对曼地亚红豆杉紫杉烷类化合物含量的影响，以期为采收和更有效利用曼地亚红豆杉这一珍贵的药用植物资源提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

2016年2月分别于海南和四川采集人工栽培不同生长年限的曼地亚红豆杉植株上无病虫害、生长健康具有代表性的枝条若干。海南2 ～8年生曼地亚红豆杉枝条采自海南省澄迈县，四川2 ～7年生曼地亚红豆杉枝条采自四川省眉山市。将采集的样品在烘箱中60℃烘干至恒重，利用高速万能粉碎机将样品粉碎(过60目筛)，待用。

10-DABⅢ对照品(批号15987，美国MCE公司)；三尖杉宁碱对照品(批号CJ0708QA14，上海源叶生物科技有限公司)；紫杉醇对照品(批号T05M7F10533，上海源叶生物科技有限公司)；乙腈(批号141252，美国赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；以上试剂纯度均≥98%(HPLC)。水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-10AVP型DAD紫外检测器(日本岛津公司)；DFT-50型高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；BT 125型电子天平(十万分之一)(德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.3 方法

参照陈立国等方法并作适当改动进行测定[10]。

1.3.1 色谱条件

Agilent HCC-18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)和超纯水(B)为流动相进行梯度洗脱(0～15 min，30%→40%；15～30 min，40%→45%；30～50 min，45%→75%；50～60 min，75%→100%；60～70 min，100%→25%)；紫外检测波长227 nm;进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃。该条件下3种对照品和样品色谱图见图1。

1.3.2 对照品溶液的制备

于5 mL容量瓶中，精密称定3种对照品适量，甲醇溶解并稀释至刻度，分别得浓度为1.500 mg/mL的10-DAB Ⅲ、3.000 mg/mL的三尖杉宁碱、0.840 mg/mL的紫杉醇，摇匀，备用。

1.3.3 供试品溶液的制备

分别取2.0 g粉碎的样品，于室温下用V(甲醇)(5 mL)∶V(CHCl3)(5 mL)=1∶1混合液超声浸提3次，每次浸提30 min；合并浸提液，过滤后真空浓缩，再用1 mL甲醇溶解，过微孔滤膜，即得。

图1 混合对照品(A)和样品(B)色谱图 注：1：10-DAB Ⅲ；2：三尖杉宁碱(cephalomannine)；3：紫杉醇(taxol)。

1.3.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取混合对照品溶液1、5、10、13、15、20 μL进样测定，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。各对照品的回归方程、相关系数及线性范围见表1。

1.4 数据处理

应用Excel进行数据计算与表格绘制，运用SPSS 19.0软件统计分析数据。多组间用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较选用RSD法，P<0.05表示存在显著性差异，P<0.01表示存在极显著性差异。

表1 曼地亚红豆杉中3种活性成分的线性回归方程

2 结果与分析

2.1 不同生长年限海南曼地亚红豆杉3种活性成分含量的比较

不同生长年限海南曼地亚红豆杉3种活性成分含量的对比见表2。由表2可知，不同生长年限的海南曼地亚红豆杉3种活性成分含量间均存在极显著差异(P<0.01)。10-DAB Ⅲ含量依次为HN3>HN5>HN7>HN6>HN2>HN4>HN8，3年生枝条10-DABⅢ含量最高为0.017 5%，其次为5年生枝条为0.014 8%，3年生枝条中10-DAB Ⅲ含量除与5年生二者间不存在显著性差异(P>0.05)外，均显著高于其他生长年限的曼地亚红豆杉；8年生枝条10-DABⅢ含量最低仅为0.002 5%，分别只有3年生和5年生枝条的14.29%和16.89%。三尖杉宁碱含量依次为HN7>HN4>HN8>HN3>HN5>HN6>HN2，7年生枝条三尖杉宁碱含量最高为0.068 4%，与3、4、8年生枝条间不存在显著性差异，但均极显著高于2、5、6年生枝条中三尖杉宁碱含量(P<0.01)；7年生枝条中三尖杉宁碱含量分别比2、5、6年生枝条增加了66.96%、51.61%、56.87%。紫杉醇含量依次为HN3>HN7>HN2>HN6>HN5>HN4>HN8，3年生枝条紫杉醇含量最高为0.039 0%，极显著高于其他生长年限枝条中紫杉醇含量(P<0.01)，其次为2年生和7年生枝条分别为0.030 3%、0.030 5%，但后二者间紫杉醇含量不存在显著性差异；4年生和8年生枝条中紫杉醇含量最低不到0.02%，且二者间不存在显著性差异，3年生枝条中紫杉醇含量分别是4年生和8年生枝条的2.07、2.52倍。

表2 不同生长年限海南曼地亚红豆杉3种活性成分含量的比较

注：HN2～8分别代表海南澄迈2～8年生曼地亚红豆杉枝条。表中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.2 不同生长年限四川曼地亚红豆杉3种活性成分含量的比较

不同生长年限四川曼地亚红豆杉3种活性成分含量的对比见表3。由表3可知，不同生长年限的四川曼地亚红豆杉3种活性成分中三尖杉宁碱含量间存在极显著差异，而10-DAB Ⅲ和紫杉醇含量间均不存在显著性差异(P>0.05)。10-DAB Ⅲ含量依次为SC4>SC3>SC2>SC7>SC5>SC6，4年生枝条10-DABⅢ含量最高为0.030 1%，与2年生和3年生枝条间不存在显著性差异，但2、3、4年生枝条与5、6、7年生枝条间存在显著性差异(P<0.05)；5、6年生枝条10-DAB Ⅲ含量最低均不到0.02%，分别只有4年生枝条的64.12%、55.81%。三尖杉宁碱含量依次为SC4>SC5>SC3>SC2>SC7>SC6，4年生枝条三尖杉宁碱含量最高为0.062 3%，与2、3、5年生枝条间不存在显著性差异，但均极显著高于6年生枝条中三尖杉宁碱含量(P<0.01)；6年生枝条中三尖杉宁碱含量最低为0.025 3%，2～5年生枝条中三尖杉宁碱含量分别是6年生枝条的2.13、2.19、2.46、2.26倍。紫杉醇含量依次为SC7>SC3>SC4>SC5>SC2>SC6，7年生枝条中紫杉醇含量最高为0.037 0%，6年生枝条中最低为0.030 8%，但不同生长年限之间紫杉醇含量差异不显著(P>0.05)。

表3 不同生长年限四川曼地亚红豆杉3种活性成分含量的比较

注：SC2～7分别代表四川眉山2～7年生曼地亚红豆杉枝条。表中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.3 相同生长年限海南和四川曼地亚红豆杉3种活性成分含量差异比较

相同生长年限海南和四川曼地亚红豆杉3种活性成分含量差异比较见图2～4。

图2 相同生长年限海南和四川曼地亚红豆杉10-DAB Ⅲ含量差异比较

图3 相同生长年限海南和四川曼地亚红豆杉三尖杉宁碱含量差异比较

图4 相同生长年限海南和四川曼地亚红豆杉紫杉醇含量差异比较

由图3可以看出，相同生长年限间海南和四川栽培曼地亚红豆杉三尖杉宁碱含量有高有低，除2年生和5年生枝条间略有差异外，其他生长年限间不存在显著性差异(P>0.05)。海南栽培3、4、6、7年生曼地亚红豆杉三尖杉宁碱含量均略高于四川相同栽培年限曼地亚红豆杉，且4年生和7年生海南栽培曼地亚红豆杉中三尖杉宁碱含量在所有测定年限间也相对更高。

由图4可以看出，相同生长年限间除3年生海南栽培曼地亚红豆杉紫杉醇含量显著高于四川栽培曼地亚红豆杉外(P<0.05)，其他生长年限内均是四川栽培曼地亚红豆杉含量更高一些，但海南栽培3年生曼地亚红豆杉紫杉醇含量在所有生长年限间均高于其他生长年限。

3 结论与讨论

植物的次生代谢是植物在长期进化中与环境相互作用的结果，受到生物和非生物因子的调控[11-12]。次生代谢产物不仅能够提高植物抵抗外界不良环境的能力，同时也是中药的主要有效成分，对很多人类疾病具有治疗作用[13]。这些药用植物次生代谢产物主要有萜类、黄酮类、甾醇类和生物碱等。10-DAB Ⅲ、三尖杉宁碱和紫杉醇等紫杉烷类均属于二萜类化合物，作为目前治疗癌症最有效的活性成分可能也是红豆杉的防御物质，这些成分在红豆杉体内的形成与积累与不同产地环境(包括海拔、降水、土壤、光照等)密不可分[14-15]。

1)海南栽培曼地亚红豆杉3年生枝条中10-DABⅢ和紫杉醇含量均最高，而8年生枝条中二者含量均最低；7年生枝条中三尖杉宁碱含量最高，8年生枝条中三尖杉宁碱含量也最低。四川栽培曼地亚红豆杉4年生枝条中10-DAB Ⅲ和三尖杉宁碱含量均最高，而6年生枝条中二者含量均最低；紫杉醇含量在不同生长年限间不存在显著性差异。不同生长年限海南和四川曼地亚红豆杉枝叶中三种活性成分含量差异的变化可能与生长环境有关，其原因可能是海南地处热带北缘，属热带季风气候，长夏无冬且降雨充沛，一年四季植物均可自然生长，生活周期相对更长更有利于10-DAB Ⅲ和紫杉醇含量的提前积累；而四川地处中国西南腹地,平均海拔远高于海南，气候区域表现差异显著，四季分明，对紫杉醇等紫杉烷类化合物积累的影响势必与海南省引种栽培曼地亚红豆杉之间存在差异，柏培磊等和杨逢建等对南方红豆杉的研究结果也很好的证明了这一点[16-18]。

2)目前，10-DAB Ⅲ、三尖杉宁碱和紫杉醇等具有显著抗癌效果的紫杉烷类化合物的提取原料主要是天然红豆杉植物, 但红豆杉属植物普遍生长缓慢, 且树皮中紫杉醇的含量低(0.01% 干重)。因此，寻找及扩大紫杉醇药源成为亟待解决的难题[19]。四川栽培曼地亚红豆杉10-DAB Ⅲ含量相比较海南栽培曼地亚红豆杉更高，尤其是4年生枝条10-DAB Ⅲ含量，可以作为10-DAB Ⅲ提取的材料来源产地。鉴于海南独特气候条件更有利于植株萌蘖生长和更快获得收益，同时考虑到修剪采收量和后期管理及土地利用率，海南栽培4年生枝条作为三尖杉宁碱粗提原料来源更优，海南栽培3年生曼地亚红豆杉作为紫杉醇粗提原料来源经济效益更高。

[1] Onrubia M,Cusido RM,Ramirez K,et al.Bioprocessing of plant in vitro systems for the mass production of pharmaceutically important metabolites: paclitaxel and its derivative[J].Current Medicinal Chemistry,2013,20:880-891.

[2] 冯巍,谈锋,谢峻.曼地亚红豆杉研究进展[J].中草药,2007,38(10):1589-1593.

[3] 董艳,孙利鑫,尹翠,等.曼地亚红豆杉栽培管理及应用的研究进展[J].安徽农业科学,2015,43(29):14-16.

[4] 张静,廖海兵,金永春,等.UPLC 法同时测定曼地亚红豆杉中3个有效成分的含量[J].药物分析杂志,2011,31(11):2073-2077.

[5] 苟晓莉,金晶,毕惠嫦,等.红豆杉枝叶提取物及紫杉烷类成分对4种肿瘤细胞的毒性作用研究[J].中国药理学通报, 2016,32(4):591-592.

[6] 于少帅,孙启武,张小平,等.南方红豆杉人工引种及野生植株活性成分含量与分布[J].应用生态学报,2012,23(10):2641-2647.

[7] 黄玺,李远.不同采集时间曼地亚红豆杉中紫杉醇含量分析[J].现代医药卫生,2013,29(12):1806-1808.

[8] 胡蕾,梅忠,李真.不同诱导子对曼地亚红豆杉紫杉醇含量的影响[J].现代农业科技,2012,41(5):12-13.

[9] 刘柿良,杨秀利,马明东,等.曼地亚红豆杉(Taxus media cv “Hicksii”)栽培基质中适宜的锰、锌、铜浓度及采收时期研究[J].植物营养与肥料学报,2015,21(2):439-448.

[10] 陈立国,刘程惠,何克江,等.HPLC法对5种红豆杉属植物中紫杉烷类化合物成分的分析[J].分析实验室,2007,26(s1):58-61.

[11] 王春丽,梁宗锁.外源刺激对植物次生代谢的调节及其信号转导途径研究进展[J].西北植物学报,2009,29(5):867-873．

[12] 段传人,王伯初,徐世荣.环境应力对植物次生代谢产物形成的作用[J].重庆大学学报,2003,26(10):67-71.

[13] 周华,朱祺,杨艳芳,等.南方红豆杉bHLH 基因克隆与序列分析[J].植物研究 2015,35(1):52-59.

[14] 宋秋烨.南方红豆杉与引种德国曼地亚红豆杉茎、叶中紫杉醇和10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ含量的比较[J].西北药学杂志,2014,29(2):129-132.

[15] 高银祥,杨逢建,张玉红,等.南方红豆杉枝叶中6种紫杉烷类化合物含量季节变化[J].植物研究,2014,34(2):266-270.

[16] 柏培磊,孙启武,蒋继宏,等.不同产地南方红豆杉枝叶的紫杉醇含量及其指纹图谱的比较分析[J].植物资源与环境学报,2012,21(1):64-69.

[17] 杨逢建,庞海河,张学科,等.光胁迫对南方红豆杉叶片中叶绿体色素和紫杉醇含量的影响[J].植物研究,2007,27(5):556-557.

[18] 杨逢建,庞海河,祖元刚,等.南方红豆杉生长发育及其紫杉醇含量与环境因子的关系[J].植物研究,2010,30(6):742-746.

[19] 申甜,邱飞,陈敏,等.曼地亚红豆杉IPI基因克隆与功能鉴定[J].药学学报,2015,50(5):621-626.

ThreeEffectiveComponentsofTaxanesfromTaxusmadiaRehd.:ComparativeStudyofDifferentGrowthPeriodandofDifferentOrigin

LIU Jian-hui1, MA Sheng-jun2*, MA Liu-chun2, CAO Xue-qin3, LIANG Shuo1,LV Miao2, WANG Ying2,4, WANG Wan-yong4, LUO Jian-min3

(1.LishuiAgriculturalResearchInstitute,Lishui323000,China;2.XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;3.XinjiangAutonomousAcademyofInstrumentalAnalysis,Urumqi830011,China;4.ChengMaiXingdaRuralAgriculturalCompany,Chengmai571900,China)

Objective: To analyze and compare the content differences of three effective components of taxanes inTaxusmadiaRehd. of different growing years from Hainan and Sichuan. Methods:The relevant components were obtained by ultrasonic extraction with the mixed liquor of CH3OH and CHCl3, and CH3OH for dissolving afterwards. 10-deacetyl-bacratin(10-DAB Ⅲ), cephalomannine and taxol were detected and compared by HPLC. Results: ForT.madiain Hainan, the contents of 10-DAB Ⅲ and taxol were the highest at year of three, and the contents of cephalomannine reached the highest at year of seven. ForT.madiain Sichuan, the contents of 10-DAB Ⅲ and cephalomannine were the highest at year of four, and the contents of taxol had no significant differences among different growing years(P>0.05). At the same growth period, the contents of 10-DAB Ⅲ ofT.madiain Sichuan were generally higher than that in Hainan, the contents of cephalomannine were uncertain, and the contents of taxol of three-yearT.madiain Hainan were the highest. Conclusion: The contents of 10-DABⅢ ofT.madiain Sichuan were higher than that in Hainan, and which could primarily be used as a source of material origin. However, the four-year and three-yearT.madiain Hainan were more suitable as material source of cephalomannine and taxol respectively.

Hainan; Sichuan; Growth period;TaxusmadiaRehd.; Taxanes

R28

A

1002-2406(2017)06-0009-05

海南省重点研发计划项目(No.ZDYF2016147)

刘建慧(1971-)，男，学士，主要从事林木育种与推广研究工作。

马生军*(1977-),男，博士，副教授,主要研究方向：中药材规范化生产及其质量安全评价。

2016-12-21

修回日期：2016-12-31