贞术消积汤抑制STAT3/Survivin信号通路诱导肝癌细胞自噬实验研究

孙阳，吴勃岩，孙敏，王艳杰，车艳新

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

贞术消积汤抑制STAT3/Survivin信号通路诱导肝癌细胞自噬实验研究

孙阳，吴勃岩*，孙敏，王艳杰，车艳新

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：通过观察贞术消积汤作用H22移植瘤后细胞形态学变化，探讨该复方体内抗肿瘤的分子机制。方法：将小鼠肝癌细胞移植于 ICR小鼠皮下，贞术消积汤灌胃给药10 d；采用苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察各组细胞形态的变化；应用透射电镜观察模型组和贞术消积汤组细胞超微结构的改变；荧光定量PCR法检测Survivin mRNA表达；免疫组化法检测信号转导与转录活化因子3(STAT3)蛋白和抗凋亡因子(Survivin)蛋白表达。结果：光镜下观察发现，用药组细胞排列稀疏，组织产生大量空泡；透射电镜观察可见，贞术消积汤组细胞内发现自噬体和自噬溶酶体；与模型对照组相比，贞术消积汤组Survivin mRNA低于模型组；贞术消积汤组STAT3和Survivin表达下调。结论：贞术消积汤体内抗肿瘤的作用机制可能与其诱导细胞自噬有关，并通过抑制STAT信号通路发挥作用。

贞术消积汤；H22细胞；自噬；STAT3；Survivin

原发性肝癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，起病隐匿，病情发展迅速，患者平均存活时间短。中药疗法与手术、放疗、化疗等疗法结合起来，可以提高临床疗效及患者生存质量，减轻并发症或毒副作用，因此研究中药抗肿瘤具有重要意义。中医学认为,正气亏虚是肝癌发生发展的主要因素，癌毒是肝癌发生发展的关键，痰、瘀是发生肝癌的重要病理基础[1-3]。贞术消积汤是依据传统中医药理论及多年的临床经验而创，主治毒瘀互结、阴伤络阻，治法为滋阴解毒、活血通络,由女贞子、莪术、夏枯草、白花蛇舌草和甘草组成。复方中以女贞子和莪术为君药，女贞子滋补肝阴，扶助正气[4]；莪术破血行气，消积止痛[5]，可缓解诸药寒凉之性，防止白花蛇舌草寒凉太过而敛邪。臣以白花蛇舌草，清热解毒，清解癌毒，益气利湿[6]。夏枯草可软坚散结[7]，还具有助白花蛇舌草清热的作用，与白花蛇舌草均为臣药；佐使以甘草，助白花蛇舌草和夏枯草清热解毒，调和诸药。全方具有攻补兼施，寒温并用的组方特点。通过前期实验证实，女贞子发挥其抗肿瘤作用主要物质基础是齐墩果酸，主要通过免疫调节，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡起到抗肿瘤的作用[8-9]。在研究女贞子抗肿瘤作用的基础上，我们将进一步开展贞术消积汤的实验研究。本实验通过研究贞术消积汤对H22肝癌荷瘤小鼠的形态学影响及其分子机制，为其临床应用奠定实验基础。

1 材料

1.1 实验动物及肿瘤细胞

ICR小鼠，体质量20～22 g，雌雄各半，由黑龙江中医药大学GLP中心提供，许可证号SCXK(黑)2013-004；H22腹水型瘤株，购于北京肿瘤研究所。

1.2 药品

中药饮片由哈药集团世一堂中药饮片责任有限公司提供(批号201507)。

1.3 仪器与试剂

显微镜(日本，尼康公司，型号TS100)；切片机(德国，LEICA公司，型号2135)；透射电镜(荷兰，FEI公司，型号TECNAI G2)；电子分析天平(中国，上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号FA124)；实时荧光定量PCR仪(美国，伯乐公司，型号IQ5)；兔抗多克隆一抗rabbit anti-Survivin(博士德公司，批号BA1420-1)；rabbit anti-STAT3 (博士德公司，批号BA0621)；二抗(中山生物工程有限公司，批号PV6001)；台盼蓝(博士德公司，批号AR1175)；Survivin Antibody(RabMAb公司，批号2463-1)；GADPH antibody(Abcam公司，批号ab9485)。

2 方法

2.1 贞术消积汤药液的制备

依据人用药量，结合转换公式计算小鼠的用药量。制备剂量为每毫升含1 g、2 g生药的汤药备用，置于4℃保存，用时混匀。

2.2 动物分组

将30只小鼠称重，随机分成3组：模型组和贞术消积汤高、低剂量组。

2.3 移植瘤造模及给药方法

将H22肝癌细胞接种于ICR小鼠腹腔，待其腹部饱满后处死，置于超净工作台上，经消毒后抽取乳白色腹水。生理盐水洗涤、离心2次后，将其稀释成单细胞悬液，台盼蓝染色确定细胞成活率达到95%，生理盐水调整细胞浓度为1×107个/mL，每只小鼠右侧腋窝皮下接种0.2 mL细胞悬液，接种24 h后开始给药。贞术消积汤组按0.2 mL/只灌胃，连续给药10天；模型组以相同体积蒸馏水灌胃。

2.4 光镜及透射电镜观察肿瘤细胞形态

切下1～2 mm3肿瘤组织在戊二醛溶液中固定，其余置于甲醛溶液中固定，经脱水、透明、石蜡包埋后HE染色、封片后在普通显微镜下观察。戊二醛溶液中固定的肿瘤组织，经漂洗、锇酸处理、固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤，在透射电镜下观察细胞超微结构。

2.5 Survivin mRNA表达

通过查找Genbank数据库，查找Survivin mRNA和GAPDH mRNA的全基因序列。应用premier primer5.0软件设计引物。Survivin及GAPDH引物分别为：5′-AGCCAGATGACGACCCCATAGAGTGTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCCAG-3′和5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCTAGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。扩增的基因片段分别为：132 bp和113 bp。应用TRIzol试剂盒提取总DNA，琼脂糖电泳RNA完整。逆转录实验方法及条件同文献[4]。

2.6 STAT3和Survivin蛋白表达

采用PV二步法免疫组化检测细胞中STAT3和Survivin蛋白的表达情况。应用显微摄影系统，在物镜(40×)下随机选取8个视野，采用Image-proplus 6.0病理图像分析，统计各组阳性表达的积分光密度值。

2.7 统计分析

实验结果应用SPSS 13.0统计分析软件，组间均数差异性比较采用单因素方差分析及LSD检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 光镜下肿瘤细胞形态学特征变化情况

贞术消积汤对H22移植性实体瘤荷瘤鼠作用后，用药组瘤体体积和质量明显小于模型组。模型组肿瘤细胞圆形或椭圆形，胞核呈蓝紫色，胞质呈粉红色，细胞生长旺盛，排列紧密，核分裂相常见；肿瘤组织中血管丰富，并呈浸润性生长，可浸润到胸骨、锁骨等处，部分可见血性积液。贞术消积汤组肿瘤细胞生长状态不佳，排列渐进稀疏，细胞变性、坏死明显，肿瘤组织中也可见大量淋巴细胞，血管数量减少，出现许多空泡。

3.2 电镜下肿瘤细胞学特征变化情况

透射电镜是发现自噬静态研究的技术，被视为自噬研究的金标准[10]。自噬体的形成是自噬发生的关键性指标。模型对照组H22细胞形态不一，胞质中细胞器完整，线粒体中嵴清晰可见。相对于模型对照组(图1A)，贞术消积汤组细胞变小，细胞核固缩、异染色质边集，高剂量组细胞中有明显的自噬体和自噬溶酶体(如箭头所示)，内含胞浆成分或细胞器。贞术消积汤低剂量组线粒体出现空泡化，内膜和嵴溶解改变(如图1B，1C所示)。

图1 电镜下H22肝癌细胞(×11 500，单箭头标示自噬体，双箭头标示自噬溶酶体)

3.3 Survivin mRNA表达的影响

通过qRT-PCR实验结果显示，贞术消积汤低剂量、高剂量组作用于H22肝癌细胞，相对于模型对照组Survivin基因mRNA表达呈浓度依赖性下调；相对于模型对照组2(2=1)，低、高剂量组分别为模型对照组的79%和53%(如表1所示)，分别降低了21%和47%。说明贞术消积汤对Survivin基因转录有明显的抑制作用。结果见表1。

表1 贞术消积汤对H22细胞Survivin mRNA表达的影响

3.4 对Survivin蛋白和STAT3蛋白表达的影响

Survivin和STAT3蛋白在H22细胞阳性信号均以胞质为主，颗粒呈棕黄色。比较各组积分光密度(IOD)，结果见表2，模型对照组IOD平均值最高。贞术消积汤组随剂量增加，STAT3和Survivin蛋白表达明显下调，具有剂量依赖性；贞术消积汤组与模型对照组相比，均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；高剂量组与低剂量相比，也具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 贞术消积汤对H22细胞Survivin和STAT3蛋白的影响

注：与模型组相比，1)P<0.05，2)P<0.01;与贞术消积汤低剂量组相比，3)P<0.05。

4 讨论

自噬是真核细胞中细胞器和部分细胞质由双层膜包裹，形成自噬体，并与内涵体融合形成自噬内涵体，最后与溶酶体融合形成自噬性溶酶体，并将包裹的内容物降解的过程[11]。自噬是细胞维持自我平衡，保证细胞正常的分化和增殖，并在细胞分化、免疫调节等方面发挥重要作用[12]。对肿瘤细胞而言，自噬既可起到保护性作用，也可起到杀伤作用。自噬的细胞死亡方式属于Ⅱ型程序性细胞死亡，也称为自噬性程序性细胞死亡[13]。本实验发现，H22肝癌细胞内有大量自噬体和自噬溶酶体，说明药物可以诱导细胞发生自噬。

调控自噬的信号转导途径很多，作为细胞中重要的信号分子，多种肿瘤细胞和组织中都能检测到过度表达的STAT3与自噬水平的异常改变，并且发生在肿瘤病理变化的不同阶段[14]。Siegelin等[15]用STAT3抑制剂(索拉非尼)作用于神经胶质瘤细胞，降低了细胞中的STAT3蛋白，诱导细胞发生自噬，进而抑制了细胞增殖。Su等[16]研究发现，抑制肝癌细胞中STAT3的过表达可以抑制自噬。这都说明STAT3对肿瘤自噬具有负性调节作用。但也有学者认为，STAT3对肿瘤自噬具有正性调节作用[17]。因此STAT3与肿瘤细胞自噬的关系存在争议。本课题研究发现，贞术消积汤对STAT3信号通路有抑制作用，并抑制其下游Survivin基因表达，进而抑制细胞增殖，诱导细胞发生自噬。说明贞术消积汤可通过负性调节STAT/Surviivn信号通路，诱导细胞发生自噬。STAT3/Survivin信号通路不仅与自噬有关，与细胞凋亡也密切相关[18-19]。本课题组已证实鳖甲煎丸可以通过抑制STAT3信号通路诱导H22细胞凋亡[20]。而自噬和凋亡之间不是孤立存在的，他们之间的关系包括：自噬为凋亡所需，自噬发生先于凋亡；自噬与凋亡相互拮抗；自噬与凋亡协同促进细胞死亡[21]。贞术消积汤诱导肝癌细胞发生自噬，如果增加剂量，是否会诱导细胞凋亡？凋亡与自噬是协同作用还是拮抗作用，针对这一问题，我们将进一步深入研究。

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ExpenimentalStudyofZhenzhuXiaojiDecoctionInducingAutophagyviaSTAT3/SurvivinSignalPathwayinHepatomaCells

SUN Yang, WU Bo-yan*, SUN Min, WANG Yan-jie, CHE Yan-xin

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To explore the in vivo antitumor mechanism of Zhenzhu Xiaoji decoction by detecting the morphology changes of H22cells. Methods: Murine hepatocarcinoma cells were injected into ICR mice and then they were given Zhenzhu Xiaoji decoction once a day for ten continuous days. The changes of cell morphology were observed under light microscopy and transmission electron microscopy(TEM); the expression of Survivin mRNA was detected by RT- PCR; and the protein expressions of STAT3 and Survivin were observed by IHC. Results: Under light microscopy, cell lineage was sparse and lots of vacuoles were produced in tissues with the medication; under TEM, there were autophagosome and autolysosome in cells; the expression of Survivin, Survivin mRNA, and STAT3 were down-regulated in the medication group compared to the model control group. Conclusion: The in vivo antitumor effect of Zhenzhu Xiaoji decoction is probably related to inducing cell autophagy by inhibiting STAT3/Survivin signal pathway.

Zhenzhu Xiaoji decoction; H22Cell; Autophagy; STAT3; Survivin

R285.5

A

1002-2406(2017)06-0041-04

国家自然科学基金青年基金项目(No.81704054);中国博士后科学基金资助项目(No.2014M551288)；黑龙江省博士后资助项目(No.LBH-Z13205)；黑龙江中医药大学优秀青年教师支持计划(No.051234)

孙阳(1979-)，女，副教授，医学博士，黑龙江中医药大学中医学博士后在站，主要从事中医药抗肿瘤分子机制的基础研究工作。

吴勃岩*(1958-)，女，教授，主要从事中医药抗肿瘤分子机制的基础研究工作。

2017-05-03

修回日期：2017-05-30