邻苯二甲酸二甲酯暴露对凡纳滨对虾壳膜几丁质酶的影响

高平章+简迪强+吕凤娇+谢晓兰

摘要：以凡纳滨对虾为试验对虾，通过不同浓度0、2、10、20 μg/L邻苯二甲酸二甲酯（DMP）暴露不同时间（120、240 h）后，采用酶促反应动力学法及实时PCR检测分析对虾壳膜几丁质酶比活力及几丁质酶 mRNA表达量差异。结果显示，DMP暴露对对虾壳膜几丁质酶比活力具有抑制作用，但不具有显著性。不同浓度DMP暴露不同时间后，对对虾壳膜几丁质酶系列基因的mRNA表达量均受到不同程度的影响，2 μg/L DMP 暴露120 h时，对虾壳膜LvCHT3 mRNA 表达量显著上升；2 μg/L DMP暴露240 h时，LvCHT2 mRNA表达量显著下降；20 μg/L DMP暴露240 h时，LvCHT6 mRNA表达量也显著下降，说明DMP对对虾生长发育具有毒性。

关键词：凡纳滨对虾；邻苯二甲酸二甲酯；暴露；壳膜几丁质酶；响应机制；比活力；mRNA表达量；水体塑化剂监控

中图分类号： S945.4+9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0155-04

通信作者：谢晓兰，博士，教授，主要从事生物化学及生态毒理学研究。E-mail：xxl_qztc@163.com。凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）别称南美白对虾，分类上隶属于节肢动物门甲壳纲十足目游泳亚目对虾科对虾属亚属，在沿海地区广泛养殖[1]。福建省地处沿海，海产养殖业是主要产业，近年来随着对虾人工养殖越来越多，养殖过程中出现的问题也越来越多，特别是养殖水体的污染问题。养殖水体中严重超标的金属离子、有机化合物等都将导致对虾体内生理生化的变化，引发对虾的蜕壳困难、生长发育缓慢、健康程度下降、患病率和死亡率升高等问题[2]。邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）等邻苯二甲酸酯类（PAEs）化合物是常见的塑化剂（别称酞酸酯），常用作增塑剂添加剂，会干扰人体内分泌和生殖系统，影响人体健康[3-4]。随着塑料制品的广泛应用，邻苯二甲酸酯类塑化剂已成为一种分布广泛的内分泌干扰物，对生态及环境健康构成了严重威胁[5-6]。

几丁质酶（EC3.2.1.14）广泛分布于各种生物体内，与对虾的生长发育、食物消化及疾病防御密切相关[7]。几丁质酶是多基因家族，黄乾生等已从凡纳滨对虾中克隆出多个几丁质酶基因，这些基因具有不同的组织分布特异性，其中凡纳滨对虾几丁质酶基因LvCHT1、LvCHT3和LvCHT4主要表达于肝胰腺；LvCHT2在眼柄中表达量；LvCHT6和LvCHT7主要在壳膜中表达；而LvCHT5组织表达差异性较小[8]。本试验通过暴露不同浓度的DMP于对虾生长环境中，观察研究暴露不同时间后，对虾壳膜几丁质酶比活力和基因表达量的变化，从而判断DMP暴露对对虾生长发育的影响。试验结果有助于阐明几丁质酶对DMP暴露的响应机制及DMP对对虾生长发育的影响机制，同时也可为对虾养殖水体的塑化剂监控提供借鉴。

1材料与方法

1.1材料与试剂

试验材料为凡纳滨对虾，购于福建省泉州秀土对虾养殖场，体长约（8.0±1.0） cm。

试验试剂：RNA提取试剂盒，OMEGA bio-tek公司；5×Prime Script Buffer，TaKaRa公司；Taq酶，TaKaRa公司；β-actin 引物（actin-F：5′-TACACCTTCACGACCACCGC-3′；actin-R：5′-TCTCCAGCGAGGAGGAGGAA-3′）、LvCHT2引物（LvCHT2-F：5′-CGGCAAGTACAGACCTGAAGACAT-3′；LvCHT2-R：5′-ATCATAATCAGCCCAAGTGTCGTG-3′）、LvCHT5引物（LvCHT5-F：5′-TGTCTCCGCTTTGGTGAGG-3′；LvCHT5-R：5′-ATGGTGGTGGGCGTATTGTT-3′）、LvCHT6引物（LvCHT6-F：5′-CGCTTTCATCCAACACCACC-3′；LvCHT6-R：5′-CCTCGCGGAGTTCCTTAACC-3′）、LvCHT7引物（LvCHT7-F：5′-CTTGTTCCAGATGGCACTG TATTT-3′；LvCHT7-R：5′-TGGTTCTTGTTCAGGTGTC TTTTC-3′），均由上海生工生物工程股份有限公司合成；牛血清蛋白，上海蓝季科技发展有限公司；考马斯亮蓝G-250，国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲酸二乙酯，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖，天津市福晨化学试剂厂；其他化学试剂，均为西隴化工股份有限公司生产，使用的蒸馏水均为玻璃重蒸水。

1.2试验方法

1.2.1酶浓度的测定配制0.1 mg/mL标准蛋白溶液与001%考马斯亮蓝G-250，取6个15 mL离心管，将其标好号，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蛋白质标准液，再加入5 mL考马斯亮蓝染液，用蒸馏水补足至6 mL，试剂空白对照，用UV-1800紫外分光光度计测定其在595 nm下的D值，然后以标准蛋白量（μg）为横坐标、以D值为纵坐标，绘制标准曲线，过原点回归得标准曲线方程：y=4.62×0.001x，r2=0.992。采用相同的方法，以提取的几丁质酶液代替标准蛋白溶液测定酶蛋白浓度。

1.2.2凡纳滨对虾DMP暴露试验与取样凡纳滨对虾在实验室驯养稳定后进行暴露试验。对虾养殖条件：水温为（22±1） ℃，比重为1.010，盐度为1%，pH值为7.6。DMP暴露设计：设置4个DMP梯度浓度组，分别为0、2、10、20 μg/L（二甲亚砜助溶），每个浓度组设3个平行组。暴露试验在 50 cm× 35 cm×30 cm的养殖桶中进行，放试液 20 L，随机放入试验对虾50尾，试验期间每天喂食一定量，每天定时换 10 L 试液，持续增氧。分别暴露120、240 h后，每桶分别取3尾对虾，用蒸馏水将取样对虾冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，将壳膜放入研钵中加入适量Tris-HCl缓冲液研磨，置 4 ℃ 抽提1 h后，12 000 r/min下冷冻离心，取中间澄清液，即得几丁质酶粗酶液，冷冻以备分析几丁质酶比活力和mRNA表达量。endprint

1.2.3几丁质酶比活力的测定参见文献[9]，以葡萄糖作标准物，采用DNS法测定还原糖浓度，以葡萄糖量（mg）为横坐标、以D500 nm为纵坐标绘制标准曲线，得回归曲线方程y=1.25x（r2=0.998）。参照文献[10]制备胶体几丁质，再用蒸馏水调胶体几丁质溶液至终浓度为1%。取0.5 mL 1%胶体几丁质溶液和0.5 mL （pH值为 6.0）0.1 mol/L磷酸缓冲液混合后，在45 ℃下预热10 min，加入0.3 mL几丁质酶液和02 mL蒸馏水，45 ℃下反应1 h，沸水浴20 min终止反应，并迅速冷却后再加入1.5 mL DNS试剂，再沸水浴20 min，冷却到室温后用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，离心后取上清，并以灭活的等量酶液按上述步骤作空白对照，在500 nm下测吸光度。以还原糖的生成速度来衡量几丁质酶活力。酶活力单位定义为：在45 ℃、pH 值6.0的测活条件下，水解胶体几丁质生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为1个活力单位。比活力定义为：1 mg酶蛋白具有的酶活力单位。

1.2.4几丁质酶mRNA表达量的测定

1.2.4.1总RNA的提取、纯化与反转录快速取约100 mg壳膜加入1 mL RNA-组织裂解液和3颗钢珠，用匀浆机匀浆3 min，4 ℃放置30 min，加入200 μL三氯甲烷，混匀，在冰上放置10 min，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清液加入250 μL无水乙醇混匀，用HiBind RNA Spin柱子过滤，分别用300、400 mL Wash Buffer Ⅰ冲洗柱子各1次，再用500 mL Wash Buffer Ⅱ冲洗柱子2次，并在10 000 r/min离心1 min去除缓冲液，在14 000 r/min下离心2 min甩干，用40 μL DEPC-水将mRNA溶解转移至新的离心管中，即得到总RNA。用微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。

RT-PCR反应体系：2 μL的5×Prime Script Buffer（含有Prime Script RTase、RNase Ⅰnhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反应Buffer），500 ng RNA，最后用 DEPC-水补足至10 μL；反应条件为：37 ℃反转录15 min，85 ℃ 反转录酶失活5 s。在该反转录体系及条件下反转录得cDNA。

1.2.4.2几丁质酶的实时荧光PCR在LightCycle 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应体系为：Taq酶（含有TaKaRa Ex Taq HS DNA 聚合酶、dNTP mixture、Mg2+ 、Tli RNaseH和SYBR Green Ⅰ）10 μL，前后引物（0.4 μmol/L）各0.8 μL，DEPC-水6.4 μL，cDNA模板2 μL。反应条件为：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃引物退火20 s，40个循环。

1.2.5SPSS数据分析将试验数据用 SPSS 20.0软件进行单因子方差（ANOVA）和Duncans统计分析，得到“平均值±标准差”，当P<0.05时，表示差异显著。

2结果与分析

2.1DMP暴露对对虾壳膜几丁质酶比活力的影响

以“1.2.2”节的试验方法对凡纳滨对虾进行不同浓度DMP的养殖暴露，分别于暴露120、240 h后取样制备壳膜几丁质酶粗酶液，测定酶浓度和酶活力，SPSS分析比较对虾在0、2、10、20 μg/L DMP暴露120、240 h下的壳膜几丁质酶比活力变化情况，具体试验结果见表1。

2.2DMP暴露对对虾壳膜LvCHT2基因mRNA表达量的影响

采用“1.2.4”节的方法，快速取0、2、10、20 μg/L DMP暴露组凡纳滨对虾的虾壳，提取mRNA，反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR，记录其复制次数。以Lv-actin为内参，根据文献[11]中ΔΔCT（差别循环数）=（CT，目的基因 -CT，内参基因）DMP暴露组-（CT，目的基因-CT，内参基因）空白对照组用浓度代替其中的时间即可计算在不同浓度下的ΔΔCT 值，再计算2ΔΔCT 即可得出差别扩增倍数。暴露DMP 120、240 h对LvCHT2 mRNA表达量的扩增结果见表2。不同浓度DMP暴露120 h后，随着暴露的DMP浓度增大，LvCHT2 mRNA表达量起着先降后升的影响趋势，进一步采用SPSS单因素方差分析试验数据，结果得P=0.218<0.05，说明影响趋势没有显著差异。但随着暴露时间延长，随着DMP暴露浓度增大，LvCHT2 mRNA表达量變成先降后升的趋势，进一步采用SPSS单因素方差分析试验数据，结果得P=0.048<0.05，说明该影响趋势具有显著差异。2 μg/L DMP暴露对LvCHT2 mRNA表达量的影响与其他浓度组（0、10、20 μg/L）相比显著下降，其中与空白对照组相比，LvCHT2 mRNA表达量下降78.8%。

2.3DMP暴露对对虾壳膜LvCHT3 mRNA表达量的影响

由表 3可见，不同浓度DMP暴露120 h对对虾壳膜LvCHT3 mRNA表达量的影响如同对LvCHT2 mRNA表达量的影响。不同浓度DMP对LvCHT3 mRNA表达量的影响趋势也是呈现先降后升的影响趋势，进一步采用SPSS单因素方差分析得P=0.007<0.05，说明影响趋势具有显著差异。2 μg/L DMP暴露对LvCHT3 mRNA表达量的影响与其他浓度组的表

2.6DMP暴露对对虾壳膜LvCHT7 mRNA表达量的影响

由表6可见，不同浓度的DMP暴露120 h后，LvCHT7 mRNA的表达量均受到不同程度的抑制，进一步采用SPSS单因素方差分析，结果得P=0.104>0.05，说明抑制效果没有显著性。但随着暴露时间的延长，当不同浓度的DMP暴露 240 h 后，与空白组相比，LvCHT7 mRNA表达量出现大幅提升，进一步采用SPSS单因素方差分析，结果得P=0.475>005，说明影响没有显著性。与其他浓度组相比，2 μg/L DMP暴露240 h后，LvCHT7 mRNA表达量的提升幅度最大，与空白组相比，LvCHT7 mRNA表达量提升了480%。endprint

3讨论与结论

DMP在当今社会生产中大量使用，DMP已经成为环境检出率较高的重要环境污染物之一，福建九龙江水样含有DMP、DEHP、DEP、DOP、BBP和DBP等各种PAEs有机化学污染物，最高含量分别达1.64、3.77、11.70、0.31、0.14、17.20 μg/L[12]。福建泉州湾表层海水中DMP等PAEs 的总含量在18.77～191.51 ng/L 之间，平均值为 82.28 ng/L [13]。PAEs 易溶于脂肪，所以水体中PAEs可在水生动物体内富集，具有较强的生态毒性。李文英等对斑马鱼进行20 d 的PAEs类物质慢性染毒试验，发现随PAEs类物质浓度增大和暴露时间延长，斑马鱼肝脏、鳃中的SOD和ATPase 活力均显著受到抑制[14]。本试验发现，DMP暴露240 h对对虾的体长、体质量没有显著影响，但随着暴露时间增长，对虾的死亡率有所上升；DMP暴露后，与对虾生长发育密切相关的壳膜几丁质酶比活力均出现不同程度下降，但这种抑制效果没有显著性，没有显著性可能是DMP的暴露时间不够长及暴露浓度不够高。但2 μg/L DMP暴露120 h时，使对虾壳膜LvCHT3 mRNA表达量显著上升，其他不同浓度组暴露120 h后也出现不同的影响效果，但不具有显著性；各浓度组DMP暴露120 h对壳膜LvCHT2、LvCHT5、LvCHT6、LvCHT7也均有不同的影响趋势，同样不具有显著性。不同浓度的DMP暴露240 h后，对各种几丁质酶基因的mRNA表达量也出现不同程度的影响，2 μg/L DMP暴露 240 h 时，LvCHT2 mRNA表达量显著下降；20 μg/L DMP暴露240 h时，LvCHT6 mRNA表达量也显著下降；而其他浓度组暴露240 h对LvCHT2 mRNA、LvCHT6 mRNA的表达影响均不具有显著性；各浓度DMP暴露240 h后对LvCHT3、LvCHT5、LvCHT7的mRNA影响也均没有显著性。说明DMP暴露具有基因毒性，DMP暴露可能通过对与对虾生长密切相关的几丁质酶系基因表达影响来影响对虾的生长发育，这种毒害会造成永久性毒害并相应产生具体的表观病态现象。

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