呼吸内胚层及第二生心区与小鼠胚胎心动脉端发育关系

李慧超+师亮+杨艳萍

【摘要】 目的：探讨呼吸内胚层及第二生心区与小鼠胚胎心动脉端发育的关系。方法：对35例胚龄9～13 d小鼠胚胎心连续石蜡切片应用抗音猬因子（Shh）、抗Ptc1、抗Smo、抗心肌肌球蛋白重链（MHC）、抗胰岛因子（ISL-1）、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体进行免疫组织化学和免疫荧光化学染色。结果：胚龄9～11 d，呼吸内胚层开始发育，其腹侧形成Ptc1阳性的内胚层细胞索，与紧邻的第二生心区咽前ISL-1阳性间充质细胞形成对称的锥体形结构，顶端突入动脉囊腔。胚龄12～13 d，随内胚层细胞索消失，气管腹侧ISL-1阳性间充质细胞数量明显减少，心包内主动脉和肺动脉分离。結论：发育中的呼吸内胚层可能通过Shh信号通路为第二生心区咽前ISL-1阳性间充质细胞的发育聚集提供位置信息，参与小鼠胚胎心流出道的正常形态发生。

【关键词】 呼吸内胚层； 第二生心区； 小鼠； 免疫组织化学； 免疫荧光

【Abstract】 Objective：To explore the relationship of pulmonary endoderm and the second heart field with development of the distant of the mouse embryonic heart.Method：Serial sections of thirty-five mouse embryos from embryonic day（ED）9 to embryonic day（ED）13 were stained immunohistochemically or immunofluorescently with antibodies against Sonic Hedgehog（Shh），Patched（Ptc1），Smoothened（Smo），myosin heavy chain（MHC），islet 1（ISL-1），α-smooth muscle actin（α-SMA）.Result：From ED9 to ED11，pulmonary endoderm started to develop，and formed a solid endoderm cord with Ptc1 positive expression which was surrounded by ISL-1 positive prepharyngeal mesenchyme in the second heart field projected into the aortic sac.During ED12 to ED13，following the disappearance of endoderm cord，the quantity of ISL-1 positive mesenchyme cells was obviously reduced，aorta and pulmonary artery were totally seprated.Conclusion：The developing pulmonary endoderm probably provides the positional information for the aggregation of ISL-1 positive prepharyngeal mesenchyme in the second heart field to take part in the morphogenesis of the outflow tract in mouse embryonic heart.

【Key words】 Pulmonary endoderm； Second heart field； Mouse； Immunohistochemisty； Immunofluorescence

First-authors address：Changchun Medical College，Changchun 130031，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.001

胚胎心流出道的正常发育和分隔保证了机体血液循环的有效进行[1]。近年研究表明，胚胎心流出道的分隔和延长有赖于第二生心区心前体细胞的参与[1-2]。位于咽前胰岛因子（ISL-1）是心前体细胞较好的标记蛋白，敲除ISL-1基因小鼠胚胎右心室、流出道缺失[3]。Shh信号通路参与维持第二生心区细胞的存活和增殖，条件性敲除前肠内胚层处Shh信号通路中任一成员，均引起相似的呼吸系统及流出道发育畸形[4-6]，但由于转基因或敲基因引起的心脏畸形动物多死于胚胎早、中期，对流出道正常发育的关系鲜见报道。本实验观察Shh信号通路分子在前肠呼吸内胚层的表达规律，探讨其与第二生心区咽前ISL-1阳性间充质的关系，为进一步阐明流出道发育畸形提供一定的形态学基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 取2～3月龄健康中国昆明雌性小鼠（山西医科大学实验动物中心提供）20只，体质量25～30 g。在明暗周期条件下饲养，动情期与同种雄鼠合笼过夜，次晨发现阴栓者即妊娠0.5 d。妊娠小鼠经剖腹收集9～13 d胚胎共计35例，其中9 d胚胎连带子宫，10～13 d胚胎从子宫内剥离，均经混合固定液固定24 h，固定液比例为甲醇∶丙酮∶水=2∶2∶1，后经脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制作厚度为6 μm的连续石蜡切片。每隔6片取1片做HE染色，其余切片进行免疫组织化学染色及免疫荧光化学染色。

1.2 免疫组织化学染色 标本经脱蜡、水化后，3%过氧化氢和TENG-T（Tris 10 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，0.25% gelatin，0.05% Tween-20，pH 8.0）[7]各封闭30 min，再分别用山羊抗Ptc1（1∶100，Santa Cruz）、抗Smo（1∶150，Santa Cruz）多克隆抗体，小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，1∶1000，1A4，Sigma）、抗Shh（1∶40，Developmental Studies Hybridoma Bank）、抗心肌肌球蛋白重链（MHC，1∶1000，Upstate）单克隆抗体，兔抗ISL-1（1∶200，AB Tech）多克隆抗体室温孵育过夜，最后依次经兔抗小鼠IgG或兔抗羊IgG、羊抗兔IgG和兔过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物分别孵育[8]，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。endprint

1.3 免疫荧光化学染色 切片脱蜡、水化、封闭处理后，兔抗ISL-1（1∶100，AB Tech）抗体分别与山羊抗抗Smo（1∶50，Santa Cruz）、Ptc1（1∶20，Santa Cruz）抗体混合，切片室温孵育过夜，混合二抗FITC-驴抗兔IgG（1∶50，Santa Cruz）和Cy3-驴抗山羊IgG（1∶50，康为世纪生物有限公司）孵育1 h，核复染10 min，封片，荧光显微镜照相。

2 结果

（1）胚龄9 d，心管弯曲成襻，前肠与动脉囊之间间充质细胞极少，前肠腹侧壁内胚层局部增厚，将向呼吸系统发育，称之为呼吸内胚层，呈Shh阳性表达（图1A），心管动脉端可见ISL-1阳性细胞，并与心肌特异性MHC表达重叠（图1B～C）。（2）胚龄10 d，呼吸内胚层继续增厚并向腹侧突出，呈Ptc1阳性表达（图2A），表明呼吸内胚层向喉气管沟发育，呼吸内胚层与动脉囊之间间充质细胞增多，并在内胚层突起周围呈ISL-1较强表达（图2B）。（3）胚龄11 d，喉气管沟继续发育，其顶端形成ISL-1和Ptc1双阳性实心内胚层细胞索（图3A），指向动脉囊背侧壁间充质，ISL-1阳性细胞围绕喉气管沟形成对称的锥体形结构，并随发育细胞数量逐渐增多，锥体形结构范围不断扩大，其顶端与流出道心内膜垫相融合，形成主肺动脉隔雏形，免疫荧光双染可见ISL-1和Smo双阳性细胞（图3B），此时前肠背侧食管内胚层周围未见其聚集。（4）胚龄12 d，气管在流出道水平已与食管完全分隔，气管腹侧的内胚层细胞索缩短变粗，细胞排列变松散，与周围間充质分界不清晰，但仍呈Ptc1阳性，气管腹侧ISL-1阳性锥体形结构体积明显减小，锥体顶端指向主肺动脉隔，表达较强的α-SMA（图4A～C）。（5）胚龄13 d，气管腹侧细胞索消失，ISL-1阳性间充质细胞数量明显减少，气管失去Ptc1表达（图5A～B）。

3 讨论

3.1 呼吸内胚层与第二生心区咽前ISL-1阳性间充质分布规律 胚龄9 d，前肠内胚层腹侧上皮逐渐增生，呼吸内胚层开始发育。至胚龄10 d，前肠呼吸内胚层腹侧的ISL-1阳性间充质细胞开始出现并逐渐增多，前肠腹侧ISL-1阳性间充质细胞是第二生心区的主要组成部分[9-10]，其出现在呼吸内胚层发育之后，说明两者的发育可能存在相关性。随喉气管沟的延伸，前肠和动脉囊之间的ISL-1阳性间充质细胞数量不断增加，围绕喉气管沟呈对称的锥体形结构[11]，实验中发现前肠背侧食管内胚层周围未见ISL-1阳性细胞聚集，说明呼吸内胚层诱导ISL-1阳性细胞形成的锥体形结构具有特异性。喉气管沟不断向动脉囊背侧壁方向延长，特征性锥体形结构的顶端随之突入动脉囊腔，与动脉囊背侧壁融合，最终形成主肺动脉隔，喉气管沟腹侧的实心内胚层细胞索至胚胎发育13 d流出道分隔完成后才消失，说明第二生心区咽前ISL-1阳性间充质细胞可能是在呼吸内胚层提供的位置信息引导下正确分布、迁移，完成流出道的正常分隔的。

3.2 Shh信号通路分子与呼吸内胚层发育 陆地动物生后存活需要心血管系统和呼吸系统的共同发育[12]。前肠内胚层既在胚胎心流出道形态发生中发挥重要作用，也是呼吸系统发育的起源，而前肠的发育有赖于内胚层上皮与邻近间充质间多种信号因子的相互作用[13-14]。Shh是分泌性糖蛋白，有研究表明，在前肠内胚层可分泌Shh[15-16]，其信号传递受靶细胞膜上受体Ptc1和Smo的控制，特异性敲除小鼠内胚层Shh基因或第二生心区ISL-1表达区域的Smo基因会引起流出道和心房发育畸形[15-18]，说明前肠呼吸内胚层借Shh信号系统与ISL-1阳性的第二生心区存在某种相关性。本实验观察到，胚龄9 d，Shh表达于开始发育的呼吸内胚层，随发育表达逐渐减弱，而Ptc1表达增强。Ptc1的表达强度限制Shh的扩散范围，并可代表Shh信号系统的活跃程度[19]，胚龄10～12 d，Ptc1在发育中的呼吸内胚层和实心细胞索上的表达说明Shh信号通路活化，Shh信号具有浓度依赖性和短距离作用性[20]，呼吸内胚层细胞增生和细胞索形成可能增加了Shh的分泌量，而呼吸内胚层借此以自分泌的方式调节自身和喉气管沟发育及内胚层细胞索的形成，并通过旁分泌在周围间充质中形成不同的浓度梯度，诱导ISL-1阳性间充质细胞增生，并以不同数量和密度聚集。喉气管沟顶端内胚层细胞索扩大了Shh信号的作用范围，可能也为其周围聚集的第二生心区ISL-1阳性间充质细胞提供了距离更近、更精确的位置信息。有报道表明，喉气管沟向动脉囊方向的主动生长力可能产生机械牵拉作用，进而驱动ISL-1阳性细胞向流出道方向运动，而实心细胞索的形成确保了牵拉力作用的方向，这也说明呼吸内胚层与第二生心区咽前ISL-1阳性间充质细胞在流出道的正常形态发生中具有一定的相关性[21]。

胚龄12 d，气管腹侧内胚层细胞索变短粗，细胞排列松散，课题组其他成员也观察类似现象，是否通过上皮-间充质转化为ISL-1阳性细胞尚需进一步研究。

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（收稿日期：2017-08-25） （本文編辑：程旭然）endprint