外周血p73基因联合CEA检测在结直肠癌早期筛查中的意义

龙海华　贾安平　尹琦　庞丽萍　刘振鹏

【摘要】 目的：探討外周血p73基因甲基化联合CEA检测在结直肠癌早期筛查中的临床意义。方法：选取2013年6月-2017年3月本院住院患者142例，将其分为结直肠癌组64例和结直肠瘤组78例，另选取健康体检者142例为健康对照组。采用甲基化特异性PCR（MSP）对所有受检者行血浆p73基因甲基化检测，并测定血清CEA。比较单独与联合检测联合血浆p73基因甲基化及血清CEA对结直肠癌的诊断准确性、阴性预测值、敏感性及特异性。结果：结直肠癌组血浆p73基因甲基化、血清CEA和联合检测的阳性率均明显高于结直肠瘤组和健康对照组，差异均有统计学意义（P<0.001）；且结直肠瘤组均明显高于健康对照组，差异均有统计学意义（P<0.001）。联合血浆p73基因甲基化测定和血清CEA对结直肠癌的诊断敏感性优于单独检测（ 字2=9.581、16.762，P<0.01）；阴性预测值高于单独检测，特异性低于单独检测，但差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：联合血浆p73基因甲基化测定及血清CEA对结直肠癌的早期筛查有重要的临床意义。

【关键词】 p73基因； 甲基化； 结直肠癌； 联合检测

Diagnostic Value of Peripheral Blood p73 Gene Methylation Combined with CEA in Early Screening of Colorectal Cancer/LONG Hai-hua，JIA An-ping，YIN Qi，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：119-122

【Abstract】 Objective：To explore the diagnostic value of peripheral blood p73 gene methylation combined with CEA in early screening of colorectal cancer.Method：142 cases of hospitalized from June 2013 to March 2017 were selected，they were divided into colorectal cancer group（64 cases） and colorectal tumor group（78 cases），another 142 healthy subjects were selected as healthy control group.The methylation specific PCR（MSP） was used to detect plasma p73 gene methylation in all subjects，and the serum CEA was determined.The diagnostic accuracy，negative predictive value，sensitivity and specificity of the single and combined plasma p73 gene methylation positive rate and serum CEA of colorectal cancer were compared.Result：The positive rate of p73 gene methylation，serum CEA and joint detection in colorectal cancer group were significantly higher than those in colorectal tumor group and healthy control group，the differences were statistically significant （P<0.001）；and the colorectal tumor group was significantly higher than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.001）.Joint p73 gene methylation determination of plasma and serum CEA was superior to the single detection for diagnosis of colorectal cancer susceptibility（ 字2=9.581，16.762，P<0.01）；the negative predictive value was higher than that of the individual，and the specificity was lower than that of the individual，but the differences were not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：Plasma p73 gene methylation measurement combined with of serum CEA has important clinical significance for early screening of colorectal cancer.

【Key words】 p73 gene； Methylation； Colorectal cancer； Combination of detecting

First-authors address：Liutie Central Hospital of Liuzhou City，Liuzhou 545007，Chinaendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.034

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，2015年我国CRC发病率呈明显上升趋势[1-2]，早期诊断CRC的患者5年生存率可达90%[3]。p73基因启动子甲基化的异常与肿瘤的发生、发展密切相关[4-7]，而CEA是消化道肿瘤的重要肿瘤标准物[8-11]。本研究对外周血p73基因甲基化状态及血清CEA进行检测，观察联合两种检测对CRC早期筛查的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年6月-2017年3月本院住院患者142例，患者均无明确恶性肿瘤疾病史，未接受放疗、化疗及免疫抑制等治疗。以组织病理学为依据，将其分为结直肠癌组64例，男36例，女

28例，年龄31～85岁，中位年龄52岁；结直肠瘤组78例，男43例，女35例，年龄27～88岁，中位年龄47岁；另选取健康体检者142例为健康对照组，男67例，女75例，年龄25～89岁，中位年龄42岁。本研究经医院伦理委员会审核批准，在采集外周血及组织标本前宣教本研究目的及意义，取得受检者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 病理活检确诊结直肠癌患者均行外科手术治疗，包括根治术加周围淋巴结清扫及姑息手术；确诊结直肠瘤患者行肠镜下息肉切除术或黏膜剥离术，病理提示切缘无癌细胞者予临床随访，病理提示找到癌细胞则追加手术，纳入结直肠癌组。

1.2.2 标本处理 治疗前受检者均空腹抽取外周静脉血10 mL，其中5 mL全血静止分层后，3000 r/min，离心5 min分离血浆，置于-20 ℃冰箱保存，使用时将冷冻血浆置于室温30 min后利用血清/血浆游离DNA提取试剂盒（北京天根生化科技，货号：DP339）对DNA进行裂解、磁珠结合、洗涤、洗脱等处理，获得DNA洗脱液，保存于-20 ℃冰箱中；另5 mL全血送生化室进行血清CEA检测。

1.2.3 亚硫酸盐转化 按照DNA重亚硫酸盐转化试剂盒（北京天根生化科技，货号：DP215-02）说明书进行操作，经3次洗涤及1次洗脱后回收亚硫酸盐转化的DNA洗脱液，封存于96孔板，置于-80 ℃保存。

1.2.4 p73基因甲基化特异性PCR（MSP） 将符合要求的血浆标本送本院生化免疫室，按甲基化特异性PCR试剂盒（北京天根生化科技，货号：EM101-01）说明书进行操作。PCR条件：94 ℃热启动20 min，62 ℃ 5 s，56 ℃ 35 s，93 ℃ 30 s，45个循环，40 ℃ 5 s。电泳苍梧行4%琼脂糖电泳，使用Bio-Rad公司Gel DoTM XR凝胶成像系统分析后进行测序。引物序列参照文献[12]，由北京天根生化科技公司合成，非甲基化引物（p73-U），F：5-AGGGGATGTAGTGAAATTGGGGTTT-，R：5-CCATCACAACCCCAAACATCA-3，扩增产物69 bp；甲基化引物（p73-M），F：5-GGACGTAGCGAAATCGGGGTTC-3，R：5-ACCCCGAACATCGACGTCCG-3，扩增产物60 bp。

1.3 观察指标与判定标准 p73甲基化及非甲基化预测的目标片段大小分别为60、69 bp。将扩增产物条带的大小与预测的目标片段大小进行比对，特异性扩增产物中出现大小为60 bp的扩增片段，无论是否含有69 bp大小的扩增片段，均判为p73甲基化阳性，特异性扩增片段只有大小为69 bp的扩增片段，则判为p73甲基化阴性。血清CEA>5 μg/L为阳性标准。联合检测时，如有1项检测结果阳性即判为联合检测阳性，检测结果均阴性才判为联合检测阴性。敏感性=结直肠癌组中阳性例数/结直肠癌总例数×100%；特异性=非结直肠癌组中阴性例数/非結直肠癌组总例数×100%；阳性预测值=[结直肠癌组中阳性例数/（结直肠癌组中阳性例数+非结直肠癌组中假阳性例数）]×100%；阴性预测值=[非结直肠癌组中真阴性例数/（结直肠癌组中假阴性例数+非结直肠癌组中真阴性例数）]×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验或Kruskal-Wallis检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组的血浆p73基因甲基化及血清CEA阳性率比较 结直肠癌组血浆p73基因甲基化、血清CEA和联合检测阳性率均明显高于结直肠瘤组和健康对照组，差异均有统计学意义（ 字2=16.473、18.192、33.199，P<0.001； 字2=83.700、68.700、129.633，P<0.001）；且结直肠瘤组均明显高于健康对照组，差异均有统计学意义（ 字2=24.957、13.958、33.956，P<0.001）；结直肠癌组中联合血浆p73基因甲基化测定和血清CEA的阳性率均高于单独检测，差异均有统计学意义（ 字2=14.083、9.524，P<0.01）；结直肠瘤组中，联合血浆p73基因甲基化测定和血清CEA的阳性率高于单独检测血清CEA的阳性率，差异有统计学意义（ 字2=7.692，P<0.01），与单独检测血浆p73基因甲基化的阳性率比较，差异无统计学意义（ 字2=1.973，P>0.05）；健康对照组中，联合血浆p73基因甲基化测定和血清CEA的阳性率与单独检测比较，差异均无统计学意义（ 字2=0.851、0.890，P>0.05）。见表1。

2.2 血浆p73基因甲基化及血清CEA对CRC诊断的阳性预测值、阴性预测值、敏感性及特异性比较 血浆p73基因甲基化+血清CEA联合检测对结直肠癌的诊断敏感性高于单独检测，差异均有统计学意义（ 字2=9.581、16.762，P<0.01）；对诊断结直肠癌的阴性预测值高于单独检测，特异性低于单独检测，但差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。endprint

3 讨论

随着分子生物学的发展，人们发现在肿瘤发展出现形态改变之前，往往先有癌基因的激活和抑癌基因的失活，对这些基因进行检测，将有助于结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）的早期诊断[13]。CRC发生发展是内外环境的多种因素共同参与、多阶段变化积累的过程，目前仍未明确其确切的发病机制。选择检测哪种基因，从什么标本中获取该基因才能最有效地协助CRC的早期诊断和筛查已成为人们关注的焦点。由于外周血及粪便中检测基因甲基化的可行性强，目前外周血基因检测SEPT9基因已作为CRC早期诊断的检测指标进入临床运用阶段并纳入指南[14]。随着科学技术不断发展，更多的甲基化标志物将不断被发现并与基因进行联合检测，有助于CRC的早期诊断及有效治疗[15]。

p73是抑癌基因p53家族中的成员，它的缺失或失活可活化癌基因，使细胞生长失控，导致恶性肿瘤的发生和发展[16]。因为肿瘤细胞DNA可释放入外周血，因此在患者血清和血浆内可以检测到的较高浓度的DNA异常甲基化[17]，肿瘤组织中DNA异常甲基化发生更早、准确性更高，但组织学标本相对较难留取，主要受内镜检查条件、患者接受程度等客观条件影响，而内镜检查本身又受到患者肠道准备情况、病灶所处部位、检查者技术水平及检查时间等因素的影响，而且还存在出血、穿孔等内镜检查并发症，患者依从性差。外周血的标本取材更简单、方便、快捷、微创，寻找外周血结直肠癌特异性分子标志物对提高CRC的早期诊断有重要意义。本研究中，p73基因甲基化阳性率在结直肠癌组外周血中表达最高，其次为结直肠瘤组，健康对照组中p73基因甲基化阳性率较低。由此可见，在癌前病变时期就有一定的发现率，可作为报警指标，利于早期发现瘤或癌的病变，帮助CRC的早诊断及早治疗，但敏感性仅57.81%。将血浆p73基因甲基化测定与血清CEA联合，其诊断结直肠癌的敏感性优于单独检测（ 字2=9.581、16.762，P<0.01），体现了联合检测的优势。因此，血浆CEA联合血清p73基因甲基化检测可能更能适合CRC大范围筛查的需要。

随着科学技术不断发展，更多的甲基化标志物将不断被发现[18-19]。这些标志物不受性别、年龄、肿瘤部位的影响，联合检测将有助于CRC的早期诊断及有效治疗。本研究中，血浆p73基因甲基化阳性率在健康对照组-结直肠瘤组-结直肠癌组中呈逐渐升高，提示p73基因与结直肠的发生、发展可能存在一定的相关性，将p73基因作为一个靶点进行干预，或许可以成为CRC早期基因治疗的一个理想方法，或为结直肠癌的术后监测提供有效的肿瘤标志物。但目前研究所见，大规模无症状人群或轻微症状人群CRC筛查或早期诊断中，即使是已列入指南的血浆SEPT9基因甲基化检测，其阳性率及敏感度仍偏低[20]。考虑到相同分子标志的甲基化情况在不同研究和不同人群之间也有一定的差异等因素[21-22]，进一步明确血浆p73基因甲基化检测在CRC诊断中的价值，有待进行大样本、多中心的前瞻性对照研究。

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（收稿日期：2017-07-17） （本文编辑：张爽）endprint