野茼蒿对UC大鼠血清黏附分子表达的影响

彭凡珂　冯陈慧　寇力丹

【摘要】 目的：通过研究野茼蒿对溃疡性结肠炎大鼠血清相关黏附分子表达的影响，探讨其对溃疡性结肠炎的疗效。方法：选择2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）与乙醇混合液诱导的溃疡性结肠炎大鼠为研究对象，把UC模型大鼠分为：空白对照组、模型组，野茼蒿低、中、高剂量组，阳性对照组，每组各12只。每天给予各组不同药物处理。于给药21 d后对大鼠结肠组织进行CMDI和HS评分，并用ELISA法检测血清黏附分子CD62P、PSGL-1、CD44、CD54的含量，比较各组间指标差异。结果：与空白组相比，模型组CMDI评分和HS评分以及血清中黏附分子CD62P、PSGL-1、CD44、CD54明显升高（P<0.01或P<0.05）；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠上述两个评分以及黏附分子含量一定程度上降低（P<0.01或P<0.05）；与模型组相比，SASP组大鼠血清述两个评分以及黏附分子的含量明显降低（P<0.01或P<0.05）。结论：野茼蒿冻干粉对UC大鼠有一定的治疗作用，其机制可能与影响CD62P、PSGL-1、CD44、CD54的表达有关。

【关键词】 溃疡性结肠炎； 野茼蒿； 血清黏附分子

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Wild Chrysanthemum on the expression of serum-related adhesion molecules in rats with ulcerative colitis and to explore its effect on ulcerative colitis.Method：The rats of ulcerative colitis induced by 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS） and ethanol were selected as the study subjects.The UC rats were divided into six groups：blank group，model group，wild chrysanthemum Low，medium and high dose group，positive control group，12 cases in each group.Each group was given a different medication every day.At 21 days after administration，CMDI score and HS score were performed on rat colon tissue.The levels of CD62P，PSGL-1，CD44 and CD54 in serum were measured by ELISA.The differences of six groups were compared and analyzed statistically.Result：Compared with the blank group，the CMDI scores and HS scores and the levels of CD62P，PSGL-1，CD44 and CD54 in the serum of the model group were significantly increased（P<0.01 or P<0.05）；compared with the model group，the two scores and the levels of adhesion molecules in serum of the low，medium and high dose rats groups were significantly lower（P<0.01 or P<0.05）；compared with the model group，the above two scores and the content of adhesion molecules in serum of SASP group were significantly decreased（P<0.01 or P<0.05）.Conclusion：The freeze-dried powder of Wild Chrysanthemum has a certain therapeutic effect on the clinical symptoms of UC rats.The mechanism may be related to the expression of CD62P，PSGL-1，CD44 and CD54.

【Key words】 Ulcerative colitis； Wild Chrysanthemum； Serum adhesio lecules

First-authors address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.005

潰疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是一种结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病因尚不明确，病变范围广泛。目前大多认为其发病机制与免疫因素、遗传因素、心理因素、饮食因素等有关，其中免疫异常被认为是最重要的发病因素。溃疡性结肠炎治愈难度大、病程长，经常反复发作，UC的发病率在我国呈升高的趋势。目前UC临床治疗以激素、水杨酸制剂和免疫抑制剂为主，但疗效欠佳，患者易产生耐药性、过敏等不良反应。中药在治疗UC上具有一定优势，避免了传统西药的弊端，在UC的治疗上显示出了广阔前景，临床上以中药灌肠治疗效果较好[1-2]。野茼蒿（Wild chrysanthemum）是菊科茼蒿属一年或二年生草本植物，在我国境内主要分布于广东、海南、四川、云南等地，是一种常用的药食两用植物，含有多种类型化合物，可治疗慢性肠胃炎[3-5]。黏附分子CD62P、CD44、CD54参与炎症反应中的重要环节，在UC的发病过程中起到了重要作用。本实验用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）与乙醇混合液诱导UC大鼠模型，将野茼蒿应用于UC大鼠，通过检测其血清中相关黏附分子的变化水平，以期探讨野茼蒿对UC的治疗机制，为其药用价值提供临床依据，现报道如下。endprint

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性清洁SD大鼠76只，体重（220±20）g，购于哈尔滨医科大学实验动物学中心，动物合格证号SCXK（黑）2013001。

1.2 药品仪器与试剂 野茼蒿由课题组采集于组员四川家乡荒坡，选取长势良好的植株，采集后用自来水洗净干燥。取干燥野茼蒿1 kg，加适量蒸馏水浸泡，再加10倍量蒸馏水，煮沸2.5 h，重复3次，合并水煎液过滤，减压真空浓缩，冷冻干燥成冻干粉，于-20 ℃冰箱保存备用[6]。野茼蒿内服成人用量约为0.85 g/kg（野茼蒿50 g，成人体重60 kg计算）。大鼠低中高剂量用量分别为1.7 g、3.4 g、6.8 g（按成人的2、4、8倍换算）。柳氮磺吡啶肠溶片（上海中西三维药业有限公司，批号：31020450）成人每天用量为0.05 g/kg（SASP 3 g，成人体重60 kg计算），大鼠剂量0.2 g/kg（按成人4倍换算）[7]。5%TNBS（美国Sigma公司，批号：109K5008）；10%水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20130314）；大鼠CD62p、PSGL-1、CD44、CD54ELISA检测试剂盒（上海邦亦生物科技有限公司，批号：DRE20542；北京安必奇生物科技有限公司，批号：DEIA6210；上海酶联生物公司，批号：ml003353；上海酶联生物公司，批号：ml202830）；无水乙醇、蒸馏水、苦味酸。流式细胞仪（CytomicFC500型，Beckman Coulter公司）；加样枪、动物手术器械。

1.3 方法

1.3.1 造模 76只大鼠随机选取12只作为空白对照组，64只作为造模组。全部大鼠适应性喂养72 h。恒温25 ℃标准饲养，食用固体饲料，自由饮水，8 h通风换气一次，垫料24 h更换一次。造模组大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉（0.25 mL/100 g）后，用TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 mL）溶液灌肠[8]，灌肠时灌肠针轻注入大鼠距离肛门7～8 cm的肠腔内，灌肠后让其自然苏醒，注意保暖。对照组大鼠不做处理。

1.3.2 分组 造模后观察，3 d内死亡2只，再随机处死两只大鼠，解剖取其结肠观察其结肠组织，确认UC模型建立。剩下的60只大鼠随机平均分为模型组、野茼蒿低、中、高剂量组、阳性对照组（SASP组），每组12只，每组用苦味酸对大鼠编号为1～12。

1.3.3 给药 空白对照组2 mL生理盐水灌胃；野茼蒿低、中、高剂量组分别给予对应浓度的野茼蒿冻干粉解于2 mL蒸馏水溶液灌胃；阳性对照组等量柳氮磺吡啶用蒸馏水配置成200 mL的溶液灌胃，连续灌胃21 d。大鼠灌胃时将灌胃针沿左右嘴角插入大鼠嘴内，注意让针与大鼠食道成平行线，确认灌胃针插入大鼠胃内时再注入药物。

1.3.4 标本获取 于末次给药后禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠后，将大鼠迅速剖腹，取其下腔静脉血，约5 mL，离心后取血清。沿其肛门向上解剖，取其距离肛门以上2～10 cm段的结肠，沿肠系膜缘剪开展平，将结肠组织置于4 ℃无菌生理盐水中清洗片刻，去除肠腔内的残余粪便。

1.4 观察指标 对所取结肠标本进行肠黏膜损伤评分（CMDI）及组织病理学评分（HS）[9-10]；用ELISA法检测血清中黏附分子，检测方法参照ELISA检测试剂盒，操作并记录结果。对比分析各组大鼠CMDI评分及HS评分以及血清中上述黏附分子的含量的差异。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肠黏膜损伤评分及组织病理学评分比较 与空白对照组比较，模型组大鼠CMDI和HS评明显升高（P<0.01或P<0.05）。与模型组比较，野茼蒿三组的CMDI和HS评分均明显降低（P<0.01或P<0.05）；与SASP组相比，高剂量组的CMDI和HS评分较高（P<0.05），见表1。

2.2 各组血清相关黏附分子含量比较 与空白对照组比较，模型组大鼠黏附分子水平明显升高（P<0.01或P<0.05）；与模型组比较，野茼蒿三组的黏附分子水平均明显降低（P<0.01或P<0.05）；与SASP组相比，高剂量组的黏附分子水平较高（P<0.05），见表2。

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种病因尚不明确的炎症性疾病，治愈难度大。目前西药治疗副作用较大，疗效欠佳，中药对在对UC的治疗上显示出了广阔的前景。

P选择素（P-selectin，CD62p）存在于血管内皮细胞及血小板，在炎症、血栓形成中起着重要作用。其高亲和力的配体是P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein and 1，PSGL-1）。PSGL-1与CD62p的相互作用对炎症发生等生理病理过程有重要作用[11]。研究表明，CD62p在UC中表达明显上调，且CD62p单抗的抗黏附治疗对溃疡性结肠炎具有治疗作用[12-13]。血浆中CD62p及其配体的水平可能成为判断UC严重程度以及临床诊断简单易行的外周生物学指标[14-15]。CD44是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，在脊椎动物体内广泛表达[16]。CD44介导淋巴细胞与毛细血管网小静脉的内皮细胞结合，使淋巴细胞穿过血管内壁，参与炎症反应。重度UC患者组织及血液中CD44表达较对照组增高，缓解期显著下降[17-18]。CD54是免疫球蛋白超家族成员，可增强白细胞与血管内皮的黏附作用，从而促进炎性细胞渗出血管达到炎症部位。UC重度患者血浆中CD54表达高于轻度组，轻度组的表达高于缓解组及健康组[19]。炎症反应时，活化的内皮细胞释放P选择素，同时活化的白细胞表面表达P选择素的配体PSGL-1，通过CD62p和PSGL-1的相互黏附，建立白细胞与内皮细胞间联系，也作为信号受体向白细胞内传递活化信号，介导炎症反应[11，20]。CD44介导淋巴细胞与毛细血管网小静脉的内皮细胞结合，使淋巴细胞穿过血管内壁，参与炎症反應。CD54可增强白细胞与血管内皮的黏附作用，从而促进炎性细胞渗出血管达到炎症部位[11，15，17]。endprint

本实验将野茼蒿应用于UC大鼠，取血检测其血清中相关黏附分子的变化水平，对大鼠结肠做CMDI和HS评分，通过各组间对比，得出结论。实验结果显示，对比空白对照组，模型组大鼠血清中上述四种黏附分子均不同程度升高（P<0.01或P<0.05）；对比模型组，野茼蒿冻干粉的低中高剂量组大鼠血清中上述黏附分子水平不同程度降低（P<0.01或P<0.05），且野茼蒿剂量与黏附分子的含量呈负相关。CMDI评分以及HS评分结果显示，对比空白对照组，模型组大鼠的两个评分明显升高（P<0.01或P<0.05）。对比模型组，野茼蒿冻干粉的低中高剂量组大鼠的两个评分均有一定程度下降（P<0.01或P<0.05），野茼蒿剂量与黏附分子的含量呈负相关。

综上所述，野茼蒿在一定程度上可以降低UC大鼠血清中CD62p、PSGL-1、CD44、CD54的水平，对U有一定程度的的缓解作用。作为一种药食两用类植物，相比于传统西药更加温和，未来可能将野茼蒿投入到临床使用，作为口服或灌肠中药，辅助治疗溃疡性结肠炎。

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（收稿日期：2017-05-08） （本文编辑：邓朝阳）endprint