香菇菌粗酶液对猪场雾霾颗粒中菲的作用研究

周孟清，贾峰,张惠茹,宴和平，谢申伍，黄进，罗 宇,阮婷婷

（1.河南工业大学生物工程学院，郑州，450001；2.广州快大饲料有限公司，广州 511450;3.云南东恒集团生物饲料公司，曲靖富源 655500）

香菇菌粗酶液对猪场雾霾颗粒中菲的作用研究

周孟清1，贾峰1,张惠茹1,宴和平2，谢申伍3，黄进1，罗 宇1,阮婷婷1

（1.河南工业大学生物工程学院，郑州，450001；2.广州快大饲料有限公司，广州 511450;3.云南东恒集团生物饲料公司，曲靖富源 655500）

目的：近5年以来,我国雾霾污染十分严重，猪场也同受其害,雾霾中包括菲等有害物质危害猪和养殖人员的健康;以往的研究发现香菇菌分泌的漆酶等酶类可以降解多种有害物质,因此本实验研究香菇菌粗酶液对雾霾中的菲的作用,以便为消除雾霾中菲对人和动物的有害作用提供一些参考。方法：本实验首先采用L934正交实验，研究流速（0.6mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min），波长（210nm、220nm、254nm），柱温（25℃、30℃、40℃），有机相甲醇和水相之比（75∶25、70∶30、85∶15）来确定高效液相色谱仪器检测雾霾中的菲的条件参数。然后采用L934正交实验，研究温度（35℃、40℃、30℃），酶处理时间（10h、20h、30h），pH（4.0、4.4、4.8），加入酶的量（5mL、10mL、15mL）对香菇粗酶液降解雾霾中菲的影响。结果：发现最适条件：温度40（℃）,pH值4.0,处理时间30（h）,加入酶的量10（mL）；在此条件下菲含量为0.351846±0.047246 ng/m3，降解前雾霾样品中的菲含量为108.3298 ng/m3，降解率达到99.68%。结论：可以用香菇菌粗酶液来降解雾霾中的菲，香菇菌粗酶液可以被开发成为有潜力的解毒剂。

雾霾;菲;香菇菌;粗酶液;高效液相色谱;降解

0 引言

雾霆天气加剧畜禽养殖业舍内空气环境恶化,畜禽出现食欲不振、疾病率提高等现象。究其原因是雾霾颗粒直径小，大部分雾霾颗粒直径小于2.5μm,可以深入到畜禽和其它动物体内的细支气管和肺泡，且比表面积较大，易于吸附有机污染物，对畜禽和其它动物的肝、肾等脏器、神经系统、内分泌系统、生殖系统等具有急性和慢性毒性。雾霾颗粒中的有机污染物包括多环芳烃类如：苊烯、苊、芴、荧蒽、芘、苯并（a）蒽、屈、苯并（b）荧蒽、苯并（K）荧蒽、苯并（a）芘等成分[1]，多环芳烃（PAHs）被认定为一种致癌、致畸、致突变物质，危害最为显著,在目前己知的1000多种致癌物质中，超过1/3是PAHs及其衍生物,菲（phen⁃anthrene）是一种含三个苯环的稠环芳烃，分子式C14H10,菲分子量178.22。它存在于煤焦油中。菲的三个环的中心不在一条直线上,是蒽的同分异构体，为白色有光泽并发荧光的片状晶体，熔点101℃ ,沸点340℃ ,密度0.980g/cm3能升华,不溶于水，稍溶于乙醇，能溶于乙醚、冰醋酸、苯、四氯化碳和二硫化碳等，溶液具有蓝色荧光[1],菲是无色片状晶体,二苯并[a,h]菲具有致癌作用,可能引起皮肤的肿瘤[2]。因此,降解消除畜禽养殖场环境的雾霆等有害物质成为研究的必然趋势。

香菇(Lentinus edodes)不仅是一种食用菌而且还具有很高的药用价值，其子实体中存在漆酶（Lac），漆酶是一种非特异性氧化酶，能够氧化的底物至少有250种[3],这些底物中有相当一部分的结构与木质素相似；而木质素的结构复杂，化学性质不活泼，漆酶能够降解木质素且具有较高的耐热性，这利于漆酶资源的开发和利用，漆酶氧化木质素的过程已有多种理论[4]，这些理论都认为氧化过程中会形成自由基，使得单元结构之间的连接断裂；或者在漆酶和氧气条件下能够发生聚合反应，还原态漆酶被氧化还原，整个反应过程中是通过四个铜离子协同传递电子和其价态的变化来实现的[5]。

探讨和研究雾霾的组分菲的生物降解，对防治雾霾和改善畜禽养殖场空气环境质量具有十分重要的科学意义,为我国治理畜禽养殖场雾霾污染提供一种有效的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种:香菇菌种购自中国菌种保藏中心。香菇菌粗酶液由本实验室制备保存（酶活8U/mL）；雾霾样品由大气颗粒物中流量采样器采集，TH-150型（武汉天虹仪器仪表有限公司），采样平均流量为100L/min,采集地点在某猪场青年猪舍内。

1.2 主要试剂和仪器

愈创木酚,国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯；甲醇，天津四友有限公司，色谱纯；丁二酸（琥珀酸），天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯；琼脂粉，天津市科密欧化学试剂有限公司，生化级试剂；柠檬酸钠，洛阳市化学试剂厂，分析纯；无水乙醇，天津市天力化学试剂有限公司，分析纯；氢氧化钠，洛阳昊华化学试剂有限公司，分析纯；葡萄糖，天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯。

主要仪器：高效液相色谱仪1260Infinity,Agi⁃lent Technologies，配PAH专用柱;AR224CN电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；BCD-256KFA海尔冰箱，青岛海尔股份有限公司；便携式pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；飞鸽牌TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；HH-4型水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；砂芯过滤装置，津腾科技有限公司；0.22μm有机相滤膜，上海市新亚净化器件厂；T6紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；电子万用炉，北京市永光明医疗器械仪器有限公司；科友牌C30玻璃仪器气流烘干器，河南予华仪器有限公司；KQ-300E超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ZHJH-C1112B双人单面超净工作台，南京远拓科学仪器有限公司；ZX⁃MP-A1150恒温箱，郑州南北仪器设备有限公司。

1.3 正交试验设计

采用L934正交试验设计控制高效液相色谱仪的温度、波长、流速、有机相与水的配比来寻找分析雾霾溶液成份的最佳条件。之后，又通过L934正交试验控制粗酶液作用于雾霾样品的温度、pH、反应时间、加入的酶量，寻找香菇粗酶液降解雾霾样品中菲的最适条件。

1.4 PDA培养基以及倒平板与接种

称取200.40g的马铃薯，切成丁状的土豆块，在沸水浴中煮30min。称取15.02g的琼脂粉，称取20.02g的葡萄糖。溶于过滤好土豆溶液中，加蒸馏水至1L，和培养皿等仪器仪器放入高压灭菌箱中进行灭菌。

灭菌后把冷却的PDA培养基加热溶解，然后将溶解的PDA在超净工作台上进行倒平板。倒好平板后，用灭过菌的接种针对香菇菌进行接种，放入25℃的恒温箱中进行培养。

1.5 香菇粗酶的提取

将培养好的香菇菌充分碾碎，加入适量的蒸馏水在25℃的环境下泡4h，然后在3500r/min的离心机中离心5min，就得到香菇菌的粗酶液。

1.6 愈创木酚法测漆酶的酶活

取50mmol/L琥珀酸钠为缓冲液（pH4.5），在10ml反应混合液中含0.04mmol愈创木酚和1mL的粗酶液，在30℃的恒温水浴锅中反应30min后，于465nm处测定其吸光度。以灭活酶液的反应混合液为对照。（酶灭活的方法：在沸水浴中将酶液放入到其中水浴加热2～5min后，拿出放凉即视为灭活完毕）。

使用分光光度计测定吸光度。具体步骤：a、打开紫外分光光度计。b、将一对比色皿清洗干净，加入蒸馏水将波长设定为465nm进行比对，以此来检测比色皿之间是否有误差（检测后发现没有误差）。c、将反应好的酶液与灭活酶液加入到比色皿中，将灭活酶液编号为一，反应酶液编号为二作为相互对照实验，测得两者吸光度差为（0.242），经过公式1：酶活（U/mL）=106×V总×ΔA/(V酶×ε×Δt)（式1）:其中V总、V酶分别代表反应体系的总体积及反应酶液的体积；ε为吸光系数，愈创木酚的ε465=1.21×104mol-1·L·cm-1)。算得香菇粗酶液中漆酶的活性为8.0126U/mL。

1.7 雾霾样品中菲的测定（菲的测定波长是251nm）

雾霾样品的含量采用高效液相色谱法进行检测，以甲醇为有机溶剂，称取5.02g的雾霾样品溶于甲醇中，充分溶解后使用有机相滤纸进行过滤得到澄清溶液，定容至1000mL,每次进样量为20μL。采用 Agilent PAH专用柱（3um，100mm×4.6mm）。用L934正交实验,以流速（0.6mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min），波长（210nm、220nm、254nm），柱温（25℃、30℃、40℃），有机相甲醇和水相之比（75∶25、70∶30、85∶15）设计的正交表，最适的条件。最适条件为流速1.0 mL/min，温度30℃，波长210nm，有机相甲醇和水相之间的比为75∶25。菲的标准溶液的配制,称取250.6mg的菲标准品溶于甲醇溶液，配制成500mL体积备用，菲的标准液的浓度为0.5012mg/mL。

表1 雾霾检测条件的4因素3水平正交实验表

1.8 香菇粗酶液处理雾霾样品

采用L934正交实验，四因素分别是温度（35℃、40℃、30℃），处理时间（10h、20h、30h），pH（4.0、4.4、4.8），加入酶的量（5mL、10mL、15mL）。得到表2所示。

1.9 雾霾样品中某些物质的检测

按操作要求打开高效液相仪器，按照波长210nm、柱温30℃、流速1.0mL/min、有机相与水相的比为75∶25，待基线平衡后，开始进样。得出数据见表2和图2、图3、图4。

图1 菲的高效液相色谱图，菲的含量为0.5012mg/mL

表2 香菇粗酶液处理雾霾样品中菲的4因素3水平正交实验表

图2 降解前，雾霾样品中的菲的含量为108.3298 ng/m3,图中菲的保留时间为6.437，峰面积为23.62807，而此图的总峰面积为1094.92453，每次取样量为20μL。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱检测条件参数的确定结果

本实验中作者采用表1雾霾检测条件的4因素3水平正交实验表来找出高效液相色谱检测雾霾样品的最适条件，通过表1实验的结果发现序号8条件为最适条件：流速1.0mL/min,温度30℃,波长210nm,有机相和水相之间的比为75∶25。

2.2 不同条件下香菇粗酶液降解雾霾样品的效果

如图2所示，降解前雾霾样品中的菲含量为108.3298ng/m3，在温度40℃,pH值4.0,处理时间30h,加入酶的量10mL的条件下降解，菲含量为0.351846±0.047246(ng/m3)，降解率达到99.68%。

在表2的实验条件下，采用香菇粗酶液降解雾霾样品，然后通过高效液相色谱仪检测降解前后样品中物质含量的变化,可见样品中的所含物质数量发生了变化。表明此试验不但降解了菲，同时还降解了一些其他物质。

并且在试验中作者发现在添加香菇粗酶液后，雾霾样品溶液中有沉淀生成，通过对比发现粗酶液与雾霾样品中物质有反应，所以导致生成沉淀。

图3 （5a） 此图中香菇粗酶液处理雾霾样品中的菲的条件是温度40（℃）,pH值4.0,处理时间30（h）,加入酶的量10（mL）。菲的保留时间为6.307，峰面积为3.35696，总峰面积为5.29206×104,计算得出菲的含量为0.318438(ng/m3)，由图3和图4中菲的含量取平均数得0.351846±0.047246(μg/m3)。

图4 （4a） 此图中香菇粗酶液处理雾霾样品中的菲的条件是温度40（℃）,pH值4.0,处理时间30（h）,加入酶的量10（mL）。菲的保留时间为6.283，峰面积为4.02794，总峰面积为5.24855×104,计算得出菲的含量为0.385254(ng/m3)，由图3和图4中菲的含量取平均数得0.351846±0.047246(μg/m3)。

在表2中，2号和3号试验条件的降解效果也较好，2号的试验条件为在温度35℃,pH值4.4,处理时间20h,加入酶的量10mL，降解后菲的含量为0.362904±0.066193μg/m3，降解率达到99.67%；3号的试验条件为在温度35℃,pH值4.8,处理时间30h,加入酶的量15mL，降解后菲的含量为0.433875±0.613592 μg/m3，降解率达到99.60%，2号和3号条件与4号条件比较差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 高效液相色谱检测雾霾样品菲的前提条件

实验中高效液相色谱仪器的稳定对整个实验的准确都十分重要，在进样前的准备工作显得十分重要[6]，一定等到基线完全平衡时在进样，甲醇试剂必须是色谱纯级[7]，并且雾霾样品、水相和甲醇都必须经过超声脱气，来保证实验数据的准确性[8]。高效液相色谱被用来检测生物质燃烧时产生的表面活性物质,配上GC/MS检测非常有效[9]。

3.2 高效液相色谱检测雾霾样品菲的正交试验条件

何艺（2017）用固相萃取－高效液相色谱法测定PM2.5中多环芳烃的条件为柱温为35℃，流速0.5mL/min，以水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱[10]。蒲彦利（2016）研究PM2.5中16种多环芳烃的高效液相色谱测定中用Athena PAHs专用柱（4.6 mm×250 mm，5μm），柱温30℃，流动相为乙腈和超纯水，流速1.2 mL/min，进样量10μL[11]。本实验创造性的将正交实验用于高效液相色谱检测条件的优化中，得到了检测雾霾中菲和其它物质的最佳流速1.0 mL/min，温度30℃，波长210nm，流动相甲醇和水相之间的比为75∶25；正交实验设计有试验次数少，选择的试验条件水平数较多效率高的优点。

3.3 香菇粗酶液成分及活性

香菇粗酶液中含有漆酶和其它酶类，有学者研究发现氮营养素对香菇产锰过氧化酶和漆酶有影响[12]；酿酒过程中含有麦芽的副产物作为香菇的培养基可以用来产生漆酶和锰过氧化酶[13]。叶汉玲,王传槐（1997）对香菇子实体漆酶进行分离纯化，用硫酸铵分级沉淀和离子交换纤维素柱层析法，得到单一组分的漆酶，通过SDS-PAGE凝胶电泳法，测得其摩尔式量为55000，研究表明该酶的最适pH为2.6，最适温度为70℃，酶的动力学研究测出米氏常数Km值为0.142mmol[14]，本试验中对漆酶的性质未进行研究。

许多实验表明，漆酶和锰过氧化物酶不能单独降解木质素，甚至有实验表明漆酶在降解木质素时几乎不起作用,而两者在一起能有效地降解木质素；事实上对于木质素这种结构复杂的材料来说，其降解是一个复杂的多种酶体系共同作用的结果，不同的实验得到不同的结果是完全可以理解的[3]。

张玉(2006)发现香菇的静置培养优于振荡培养；最适生长及产酶条件：pH值3.5，20℃，Cu2+浓度为0.4mmol/L；阿魏酸、愈创木酚、没食子酸、黎芦醇促进香菇合成漆酶的作用不明显,会抑制菌丝生长；Tween-80不利于漆酶合成。漆酶在60℃条件下保温1h后仍残余了2%的活力；以2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)为底物的最佳反应温度是65℃,pH值为2.2(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系)[15]。孙瑞雪（2015）对虎皮香菇漆酶发酵进行优化，发酵液中漆酶活性达到462.59 U/mL，为优化前的26倍[16]。本实验中香菇粗酶液中漆酶的活性为8.0126U/mL，数值较低，因为未采取优化培养条件，若优化之后，降解雾霾中菲的效果会更好。有研究发现漆酶、碳水化合物清除酶、α-支链淀粉酶和β葡聚糖酶组成的复合体系可以用来促进香菇发酵大豆粉中酚类抗氧化剂的形成[17]。

3.4 雾霾中菲的含量分布

李建平（2017）采样地点在天津,用乙腈处理雾霾样品检测到菲的含量0.19～0.38ng/m3,含量不低[18]。何艺(2017)测定某小吃街大气颗粒物PM2.5中PAHs质量浓度,发现菲的含量为2.292～9.078μg/L，含量较高[10];王茜(2016)测定唐山市区大气PM2.5中18种PAHs的水平时，采用正己烷/二氯甲烷为萃取剂，流动相用乙腈和水，检测到菲的含量为1.8 ng/m3，采样地点位于唐山市东部和西部两所学校的门前，其附近没有明显污染源，周围无高大建筑物,使用PM2.5大流量采样器（流速为100 L/min），进气口高度离地面约1.5 m，采样时间为2013-12-01～2014-02-07，每天早晨8:00点开始采样，每个样品连续采集24h，共获得37个样品，采样所用滤膜为玻璃纤维滤膜[19]。常君瑞(2016)研究北京某地PM2.5中多环芳烃检测到菲0.12～0.20 ng/m3,以乙腈和水作为流动相[20]。江阳(2015)研究成都市不同区域的空气中在11月,12月,1月的雾霾中菲的含量为2.01～28.1,1月份污染严重[21]。

曾涛（2015）发现冬季广州市越秀区某小学16种PAHs分析结果菲的平均含量为1.401ng/m3,可见校园内污染也较严重[22]。彭希珑(2009)研究南昌市区雾霾成分,检出菲0.141～3.867 ng/m3,污染较严重[23]。高少鹏（2006）发现北京市某钢铁厂和焦化厂附近空气中大气可吸入颗粒物PM2.5中的16种EPA优控多环芳烃(PAHs)中菲的含量为12.4～77.9 ng/m3,污染情况严重[24]。

4 结论

本实验先使用正交实验法对高效液相检测条件进行优化，得到最适条件为流速1.0 mL/min，温度30℃，波长210nm，有机相甲醇和水相之间的比为75∶25。然后再用正交实验法优化香菇粗酶液降解雾霾样品中菲的条件，结果为温度40（℃）,pH值4.0,处理时间30（h）,加入酶的量10（mL）；降解前雾霾样品中的菲含量为108.3298 ng/m3，降解后菲含量为0.351846±0.047246 ng/m3，降解率达到99.68%。

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X513

A

1008-6137（2017）05-0004-07

周孟清（1976-）男，湖南长沙，讲师，主要研究方向饲料资源和添加剂开发。

2017-08-17.