抑制miR-34a减少高糖代谢记忆所致视网膜色素上皮细胞SIRT1下调和凋亡

黄焱，郑卫东，尤加慧，徐国兴

（1福建医科大学医技学院眼视光学系；2福建医科大学附属第一医院眼科，福州 350004 ）

抑制miR-34a减少高糖代谢记忆所致视网膜色素上皮细胞SIRT1下调和凋亡

黄焱1，郑卫东2*，尤加慧2，徐国兴2

（1福建医科大学医技学院眼视光学系；2福建医科大学附属第一医院眼科，福州 350004 ）

目的探讨miR-34a在视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞高糖“代谢记忆”中的作用及其机制，为糖尿病视网膜病的防治提供新的策略。方法RPE细胞用高糖培养4d后换用正常糖浓度培养4d，模拟糖尿病高糖代谢记忆模型，用miR-34a mimic和miR-34a inhibitor改变高糖代谢记忆RPE细胞内miR-34a表达，实时定量PCR检测miR-34a表达水平，免疫细胞化学和Western blot检测组蛋白去乙酰化酶Sirtuin 1（SIRT1）水平，annexin V-PI法流式细胞术检测细胞凋亡。结果实时定量PCR检测显示，高糖培养和代谢记忆可显著升高RPE细胞内miR-34a表达水平，miR-34a mimic可进一步显著上调代谢记忆RPE细胞内miR-34a表达水平，miR-34a inhibitor可显著下调代谢记忆RPE细胞内miR-34a水平；免疫细胞化学染色显示，高糖培养和代谢记忆可使RPE细胞内STRT1免疫反应性显著降低，过表达miR-34a进一步下调代谢记忆RPE细胞内STRT1免疫反应性，而miR-34a inhibitor则可抑制代谢记忆对RPE细胞内STRT1免疫反应性的下调作用；流式细胞术检测发现，高糖培养和代谢记忆使RPE细胞凋亡明显增加，过表达miR-34a进一步增加代谢记忆RPE细胞凋亡，而miR-34a inhibitor则显著抑制代谢记忆RPE细胞凋亡的增加。结论miR-34a抑制剂能通过抑制高糖代谢记忆对RPE细胞SIRT1水平的下调和细胞凋亡的增加，部分逆转高糖代谢记忆效应，防治糖尿病视网膜病变。

高糖；代谢记忆；视网膜色素上皮细胞；miR-34a；Sirtuin 1

近年来，几项大规模临床试验研究如美国糖尿病控制和并发症研究(Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）[1]、糖尿病干预与并发症流行病学研究(Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications，EDIC）[2]以及英国糖尿病前瞻性研究（United Kingdom Prospective Diabetes Study，UKPDS）[3]提出了糖尿病并发症发生的“代谢记忆”现象，即糖尿病患者早期暴露于高血糖状态可导致疾病进展和晚期并发症的发生，尽管后期高血糖水平得到改善，但这种改变持续存在，该现象被称为“代谢记忆”[4]。“代谢记忆”现象的提出标志着对糖尿病并发症发病机制的认识有了一个突破性的进展，同时也对其防治提出了新的挑战。近期研究提示“代谢记忆”原因之一可能是靶细胞的表观遗传改变。表观遗传是指在核苷酸序列不发生变化的情况下，基因的表达活性发生了可遗传的改变。这种改变是可逆的，并受到环境、饮食、药物等因素的调节。表观遗传的可逆性为研究早期干预，纠正不良“代谢记忆”提供了科学依据[5]。

高糖“代谢记忆”导致糖尿病慢性并发症的机制未明确，目前，与代谢记忆相关的表观遗传机制研究主要涉及DNA甲基化、组蛋白转录后修饰、非编码miRNA调节和染色体重塑等。miR-34a受染色体、p53及其启动子区域CpG岛甲基化等因素的调节，并通过调控多种靶基因参与调节细胞的增殖与凋亡。miR-34基因家族（miR-34a/b/c）在糖尿病大鼠视网膜中表达增加，其可调控p53转录，促进p53介导的细胞周期阻滞、细胞凋亡和衰老，从而诱导视网膜视神经和内皮细胞凋亡[6]。在高糖作用于视网膜后改变miR-34a，如何进一步通过改变表观遗传修饰，逆转视网膜的“代谢记忆”效应，达到治疗糖尿病视网膜病变的目的，目前未见相关研究报道。本课题旨在研究miR-34a是否能通过调节SIRT1表达对产生“代谢记忆”的视网膜起保护作用。

材料和方法

1 主要试剂

5mmol/L和25mmol/L葡萄糖的DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，miR-34a mimic和miR-34a inhibitor化学合成试剂购自锐博生物科技有限公司，SG Fast qPCR Master Mix（High Rox）（B639273）购自BBI公司，免疫细胞化学超敏SP（鼠/兔）（KIT-9706）试剂盒购自福州迈新公司，Tris（T0826）、SDS（S0227）、甲醇 （MT6806）、甘氨酸（G0167）、Tween-20（T0777）、BCA试剂盒（SK3021）、兔抗β-actin抗体(AB10001)、HRP偶联的羊抗兔IgG （AB10058）及ECL发光试剂盒（SK6668）等Western blot检测相关试剂购自生工生物工程有限公司，SIRT-1抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（KGA107）购自凯基生物公司。

2 细胞培养与转染

购自美国University of South Carolina的RPED407细胞复苏、传代并接种至25cm2的培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。按6孔板每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板中，补充培养液至3ml。将24孔板专用细胞爬片圆形盖玻片润湿并贴于细胞培养板底部板壁，按每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板中，补充培养液至500μl。种板12h后，转染miR-34a mimic/inhibitor。miR-34a mimic转染浓度为100nmol/L，miR-34a inhibitor转染浓度为200nmol/L。将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养96h。

3 实验分组

细胞共分为6组，正常组：5mmol/L葡萄糖的培养液培养8d（4d为1代）；高糖组：25mmol/L葡萄糖的培养液培养8d天；代谢记忆组：25mmol/L葡萄糖的培养液培养4d后，5mmol/L葡萄糖的培养液培养4d[7]；代谢记忆干预对照组：25mmol/L葡萄糖的培养液培养4d后，转染不含miR-34a mimic/inhibitor的转染试剂继续5mmol/L葡萄糖的培养液培养4d；代谢记忆miR-34a 过表达组：25mmol/L葡萄糖的培养液培养4d后，转染miR-34a mimic继续5mmol/L葡萄糖的培养液培养4d；代谢记忆miR-34a抑制组：25mmol/L葡萄糖的培养液培养4d后，转染miR-34a inhibitor继续5mmol/L葡萄糖的培养液培养4d。

4 实时定量逆转录PCR

采用柱式microRNA抽提试剂盒抽提RNA，管家基因引物序列U6(F)5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；U6 (R)5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；目的基因引物序列hsa-miR-34a (F)5’-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAG-3’；hsa-miR-34a (R)5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’； 抽 提 后 进行RNA浓度和纯度分析及完整性测试。用第一链cDNA合成试剂盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit） (SK2445)逆转录，特异性引物序列如下：miR-34a-5p RT：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACCAG-3’。把加好样品的96孔板放在ABI StepOne Plus型荧光定量PCR仪中进行反应。分别测定每个目的基因及内参U6基因扩增的Ct值，每个样本均做3个平行复孔，运用2-ΔΔCT方法计算该目的基因的相对定量。

5 STRT1的免疫细胞化学检测

将各组细胞爬片用95%乙醇固定后，按照超敏SP试剂盒说明书进行SIRT1表达的免疫细胞化学染色检测。光镜下观察各组RPE细胞中SIRT1表达的部位以及强弱，每张切片取5个视野进行摄片，应用美国显微镜图像分析软件（Image Pro Plus，IPP）对图片分析，计数每个高倍镜视野下SIRT1阳性细胞百分率和测定阳性细胞光密度（IOD）。

6 SIRT1的Western blot检测

将收集的细胞沉淀，按6孔板中的两孔作为一组样本加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，低温离心（4℃，12000r/min，10min），小心吸取上清至新的EP管，重复离心一次，小心吸取上清，取得总蛋白，BCA法测蛋白浓度。以β-actin作为内参。在10%SDS-PAGE凝胶中电泳，电压为120V，转印至PVDF膜，以5%脱脂奶粉封闭lh，用TBST将SIRT1和β-actin一抗稀释成适当的浓度，倒入盛有膜的培养皿中，温育1.5h或4℃孵育过夜。TBST液清洗3次，二抗用TBST按浓度1∶3000稀释，倒入盛有膜的培养皿中，置于脱色摇床上室温孵育1.5h。用TBST在脱色摇床上清洗4次，每次5min，取出PVDF膜，以发光试剂ECL孵育后，使用Image J图像分析软件，测定各条带的平均光密度，以目的蛋白条带的平均光密度值与内参蛋白条带的平均光密度值的比值作为目的蛋白相对水平。

7 细胞凋亡的annexin V-PI法流式细胞术检测

收集各组细胞，在1h内进行流式细胞仪分析：用流式细胞仪（BD Accuri C6）检测，激发波长Ex-=488nm，发射波长Em=530nm；annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测，PI红色荧光通过FL3通道检测；使用经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照进行荧光补偿调节，去除光谱重叠和设定十字门的位置。

8 图像分析及统计学处理

采用IPP6.0和Image J进行图像分析，SPSS17.0统计软件包进行统计分析，实验数据用±s表示，采用独立样本t检验进行分析，以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 miR-34a inhibitor抑制代谢记忆对RPE细胞内miR-34a水平的上调

对各组RPE细胞的miR-34a水平实时定量PCR检测显示，高糖组显著高于正常组，代谢记忆组高于正常组，但较高糖组降低，而与代谢记忆干预对照组无显著差异；代谢记忆miR-34a 过表达组大幅度升高，而代谢记忆miR-34a 抑制组显著低于代谢记忆组和代谢记忆干预对照组（图1），表明RPE细胞生长于高糖环境，导致miR-34a表达增加，增加后细胞离开高糖环境正常糖培养，细胞仍然持续高表达miR-34a，可以通过miR-34a 抑制剂来降低其表达水平。

图1 miR-34a抑制剂对代谢记忆RPE细胞miR-34a表达的影响。a：与正常组比较，P＜0.01；b：与高糖组比较，P＜0.01；c：与代谢记忆组和代谢记忆干预对照组比较，P＜0.01；n=3Fig. 1 effect of miR-34a inhibitor on miR-34a expression in RPE cells.a∶ P＜0.01vs normal control group; b∶ P＜0.01vs high glucose group; c∶P＜0.01 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=3

2 miR-34a inhibitor抑制代谢记忆导致的RPE细胞内SIRT1免疫反应性的降低

免疫细胞化学染色显示，SIRT1主要表达在胞核内（图2A）。高糖培养和代谢记忆的RPE细胞中，SIRT1免疫反应阳性者明显减少（图2B，图2C）；转染表达miR-34a mimic的代谢记忆RPE细胞中，SIRT1阳性细胞进一步减少（图3E），而转染表达miR-34a inhibitor的代谢记忆RPE细胞中，SIRT1阳性细胞显著多于单纯代谢记忆RPE细胞（图2F）。采用IPP6.0和Image J进行图像分析显示，各组RPE细胞中SIRT1免疫反应强度的变化趋势与阳性细胞数的变化趋势基本一致（图2G，图2H）。由此表明，miR-34a inhibitor对代谢记忆降低RPE细胞内SIRT1免疫反应性的作用具有抑制作用。

图2 miR-34a抑制剂对代谢记忆RPE细胞内SIRT1免疫反应性的影响。A，正常组；B，高糖组；C，代谢记忆组；D，代谢记忆干预对照组；E，代谢记忆miR-34a 过表达组；F，代谢记忆miR-34a 抑制组；比例尺，10µm；G，SIRT1阳性细胞数统计学分析；H，SIRT1免疫反应性统计学分析； a：与正常组比较，P＜0.01；b：与高糖组比较，P＜0.01；c：与代谢记忆组及代谢记忆干预对照组比较，P＜0.01； n=5Fig. 2 effect of miR-34a inhibitor on the immunoreactivity of SIRT1 in metabolic memory RPE cells. A, control group; B, high glucose group; C,metabolic memory group; D, metabolic memory intervention control group; E, metabolic memory miR-34a overexpression group; F, metabolic memory miR-34a inhibition group, scale bar, 10µm; G, statistical analysis on number of SIRT1 positive cells; H, statistical analysis on immunoreactivity of SIRT1; a∶ P＜0.01vs the normal group; b∶ P＜0.01 vs high glucose group; c∶ P＜0.01 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=5

3 miR-34a inhibitor抑制代谢记忆对RPE细胞内SIRT1蛋白的降低

Western blot检测表明，正常组RPE细胞中有一定量的SIRT1蛋白，高糖组和代谢记忆组SIRT1相对水平比正常组显著降低，尤以高糖组降低明显；miR-34a 过表达组SIRT1相对水平与代谢记忆组相比降低；miR-34a抑制组RPE细胞SIRT1与代谢记忆组和代谢记忆干预对照组相比显著升高（图3）。由此表明，miR-34a抑制剂有降低高糖代谢记忆反应的RPE细胞内SIRT1蛋白量的作用。

图3 miR-34a抑制剂对代谢记忆RPE细胞内SIRT1水平的影响。A，SIRT1水平的代表性Western blot检测；B，SIRT1水平的统计学分析；a：与正常组比较，0.01＜P＜0.05；b：与高糖组比较，0.01＜P＜0.05；c：与代谢记忆组合代谢记忆干预对照组比较，0.01＜P＜0.05；n=5Fig. 3 Effects of miR-34a inhibitor on SIRT1 levels in metabolic memory RPE cells. A, level of SIRT1 determined by Western blot; B, statistical analysis on SIRT1 level; a∶ 0.01＜P＜0.05 vs normal group; b∶ 0.01＜P＜0.05 vs high glucose group; c∶ 0.01＜P＜0.05 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=5

4 miR-34a inhibitor抑制代谢记忆对RPE细胞凋亡的影响

流式细胞术检测表明，正常RPE细胞的凋亡率极低，高糖培养和高糖代谢记忆可显著增加RPE细胞的凋亡率，过表达miR-34a进一步增加RPE细胞的凋亡率，转染表达miR-34a inhibitor则可显著降低代谢记忆细胞的凋亡率（图4）。

图4 miR-34a inhibitor抑制代谢记忆对RPE细胞凋亡的影响。a：与正常组比较，P＜0.01；b：与高糖组比较，P＜0.01；c：与代谢记忆组与代谢记忆干预对照组比较，P＜0.01；n=5Fig. 4 Effects of miR-34a inhibitor on the apoptosis rate of RPE cells with metabolic memory. a∶ P＜0.01 vs normal group; b∶ P＜0.01 vs high glucose group; c∶ P＜0.01 vs metabolic memory group and metabolic memory intervention control group; n=5

讨 论

miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，它们参与调节细胞的生长发育、分化、增殖和凋亡等，和机体多种生理和病理过程相关。miRNA有组织特异性、保守性和时序性等特点。近年来，一些研究表明很多特异性的miRNA在眼球组织包括角膜、晶状体、视网膜中均有特定性的表达，并具有一定特点。miR-34a作为肿瘤抑制因子，可以通过作用于靶蛋白SIRT1导致细胞周期阻滞或者细胞凋亡[8]。miR-34a在高糖培养的微血管内皮细胞中表达显著增加，miR-34a抑制剂通过增加SIRT1的表达，减弱下游信号传导并减少高糖诱导的微血管细胞的微血管生成。

血-视网膜屏障由内、外屏障组成，保持视网膜干燥透明，调节视网膜的微环境，对维持视网膜正常功能有重要作用。视网膜血管内皮细胞参与构成视网膜内屏障，视网膜的色素上皮（RPE）细胞参与构成视网膜的外屏障，具有屏障、滤过、吞噬和分泌等作用，在维持视网膜正常的生理功能方面发挥重要作用。本研究结果表明，RPE细胞生长于高糖环境，导致miR-34a表达增加，增加后细胞离开高糖环境用正常糖培养，细胞仍然持续高表达miR-34a，说明RPE细胞存在高糖代谢记忆，这种改变可以通过miR-34a 抑制剂来降低其表达水平。本研究根据Tewari[9]等报道，选择在细胞实验中采用高糖干预4天后换用正常糖浓度培养4天，来模拟糖尿病高糖“代谢记忆”模型。

“代谢记忆”影响糖网病的机制包括氧化应激与线粒体功能障碍、非酶促糖基化作用、炎症与凋亡因素、表观遗传学机制[10]。表观遗传是指在核苷酸序列不发生变化的情况下，基因的表达活性发生了可遗传的改变。Reddy认为，即使后期得到良好的血糖控制，短暂性高血糖可能介导与代谢记忆有关的持续性基因表达活性的激活[11]。

SIRT1是一类多功能蛋白，能通过使一系列的底物包括组蛋白、转录因子和共调节因子去乙酰化，正面或是负面调控靶基因的表达，从而参与调节应激反应、细胞代谢和衰老[12]。SIRT1在衰老性疾病和代谢性疾病的组织保护中起重要作用，主要表现在抗炎抗凋亡和减少血管新生方面。大多数蛋白的生物功能依赖于可逆的翻译后修饰，SIRT1可以使与细胞能量和氧化相关的代谢分子去乙酰化，因此，SIRT1可能在代谢记忆现象的发生中也发挥重要的作用[13]。Tabuchi等[14]指出在内皮祖细胞中miR-34a可能调节SIRT1的表达，研究证实阿托伐他汀通过抑制miRNA-34a上调SIRT1的表达，对冠心病中血管内皮细胞功能有保护作用。为进一步明确miR-34a与SIRT1之间的关系，本研究通过miR-34a mimic和miR-34a inhibitor干预代谢记忆组的RPE细胞，分别上调和下调miR-34a表达水平，发现用miR-34a mimic上调miR-34a后可明显降低代谢记忆RPE细胞的SIRT1水平，而以miR-34a inhibitor下调miR-34a后可抑制代谢记忆对RPE细胞SIRT1水平的降低，由此从功能学上证明了miR-34a对SIRT1的靶向调控作用。

综合本研究结果表明，持续处于高糖环境中的RPE细胞miR-34a增多，SIRT1减少，细胞凋亡增多；高糖培养一段时间后调整血糖水平至正常，这些指标仍不能恢复至正常水平，RPE细胞存在高糖“代谢记忆”现象；过表达miR-34a进一步下调SIRT1，并通过miR-34a/SIRT1通路，加重细胞凋亡；miR-34a inhibitor虽然不能使各项指标恢复至正常水平，但是可以部分降低miR-34a表达，抑制SIRT1水平的下降，并通过miR-34a/SIRT1通路减少细胞凋亡。由此提示，通过下调miR-34a，改变表观遗传，从而部分逆转高糖“代谢记忆”，可能是从分子水平上治疗糖尿病视网膜病变的新策略。

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Inhibition of miR-34a allviates downregulation of SIRT1 and apoptosis by high glucose metabolic memory in retinal pigment epithelial cells

Huang Yan1, Zheng Weidong2*, You Jiahui2, Xu Guoxing2
（
1Department of Ophthalmology and Optometry, Fujian Medical University;2Department of Ophthalmology, the Affiliated First Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou350004，China）

ObjectiveTo investigate the role of miR-34a in retinal pigment epithelium (RPE) cells with high glucose metabolic memory and explore new strategy for the prevention and treatment of diabetic retinopathy.MethodsRPE cells were cultured under various conditions. The high glucose metabolic memory model of diabetes mellitus was simulated through culturing cells in high glucose for 4 days followed by 4 days in normal glucose medium. The expression of miR-34a was measured by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The level of histone deacetylase Sirtuin 1 (SIRT1) was evaluated using immunocytochemistry and Western blot.Apoptotic cells were detected by flow cytometry using Annexin V/Propidium iodide double staining.ResultsqRT-PCR showed that miR-34a expression in RPE cells was significantly increased in high glucose and metabolic memory groups. Its expression in RPE cells with metabolic memory could be further modulated, e.g. up-regulated by MiR-34a mimic or down-regulated by inhibitor. Immunocytochemistry staining showed that STRT1 expression in RPE cells was significantly decreased in high glucose culture and metabolic memory groups. Overexpressing miR-34a further down-regulated STRT1 in metabolic memory RPE cells, while miR-34a inhibitor partially abolished the inhibitory effects mediated by metabolic memory. Flow cytometry showed that apoptotic RPE cells significantly increased in high-glucose culture and metabolic memory groups, which could be further increased by miR-34a overexpression but reduced by miR-34a inhibitor in RPE cells with metabolic memory.ConclusionMiR-34a inhibitor can partially reverse high glucose metabolic memory effect in RPE cells and prevent diabetic retinopathy likely through reducing SIRT1 expression and apoptosis.

High glucose; metabolic memory; retinal pigment epithelium cell; miR-34a; sirtuin 1

R774.1

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 006

2017-05-04

2017-10-07

福建省自然科学基金（2016J01155），福建医科大学教授基金（JS14013）

黄焱，女（1971年），汉族，教授

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：WDzheng1996@163.com