大鼠脊髓内EGFR表达与PI3K/AKt/mTOR活性的发育相关变化

徐明锋，周慧，李璐，胡利，陈东*

（广东医科大学1生理学教研室，2附属医院耳鼻咽喉科，3组织与胚胎学教研室 湛江 524000）

论著

大鼠脊髓内EGFR表达与PI3K/AKt/mTOR活性的发育相关变化

徐明锋1，周慧2，李璐3，胡利3，陈东3*

（广东医科大学1生理学教研室，2附属医院耳鼻咽喉科，3组织与胚胎学教研室 湛江 524000）

目的研究脊髓组织神经元的内在生长活性发育依赖性丢失的可能机制。方法利用免疫荧光染色、Western blot和PCR等方法检测神经系统不同发育时期（胚胎期、新生期和成熟期）脊髓组织中EGFR的表达以及PI3K/Akt/mTOR活化状态，并分析相互之间的关系。结果在神经系统发育成熟过程中，EGFR的表达水平在出生前达到高峰，出生后逐渐降低，成熟期后始终维持在一个较低的水平；PI3K/AKt信号通路活性增强的同时EGFR表达的上调及mTOR表达增加。出生后随着EGFR表达的下调，PI3K/AKt通路活性以及mTOR的表达也随之减弱。结论脊髓组织中PI3K/AKt信号通路的活性与中枢神经系统的发育成熟有关，EGFR下调导致PI3K/AKt/mTOR的活性降低可能是中枢神经系统内在生长活性发育依赖性丢失的原因之一。

PI3K/Akt信号通路； 神经发育；表皮生长因子受体

目前对于中枢神经系统内在生长活性发育依赖性丢失的机制所知甚少。已知发育期神经元的生长属于生长因子依赖性生长，其中生长因子激活的PI3K/Akt信号通路与神经发育密切相关，通路中的作用底物哺乳动物雷帕霉素作用靶点蛋白mTOR（mammalian target of rapamycin）目前被认为是决定中枢神经元内在生长活性的一个关键调控物[3,6]。表皮生长因子受体（EGFR）在中枢神经系统内表达广泛，其与配体结合后，可激活PI3K/Akt信号通路介导细胞的分裂、生长。在多巴胺能神经元和视神经节细胞上，EGF激动剂可直接促进神经元突起的发生，提示EGFR有调节神经元发生和生长的作用[7,8]。基于上述认识，我们推测神经元内在生长活性发育依赖性丢失可能与中枢神经发育进程中EGFR的下调及通过PI3K/Akt信号通路导致mTOR的活性降低，从而使成熟后神经元的生长活性处于一个极低水平有关。因此，本研究拟对胚胎期、新生期和成熟期等不同发育阶段的中枢神经系统脊髓组织中EGFR与PI3K/Akt/mTOR进行检测，试图分析发育进程中决定中枢神经元内在生长活性的mTOR与上述信号通路的关系。

材料和方法

1 实验动物

胚胎期、新生期、成熟期SD大鼠由广东医科大学实验动物中心提供，每个时期的动物数量为15只。每个阶段挑取3个时间点作为检测点。胚胎期（embryo）3个时间点为孕15天（E15）、孕17天（E17）、孕19天（E19）；新生期（newly born）3个时间点为出生后第1天（N1）、出生后3天（N3）、出生后1周（N7）；成熟期（adult）3个时间点为1月龄（A1）、2月龄（A2）、3月龄（A3）。

2 大鼠脊髓组织取材及冰冻切片制备

2.1 成熟期

别选取1月龄、2月龄和3月龄3个时间点的SD大鼠，麻醉后经4%多聚甲醛进行全身灌注固定，取T9-T11段脊柱，4%多聚甲醛固定过夜。第2天剔除脊柱上的骨骼和肌肉，剥离出脊髓组织，最后截取长度为1.5cm的脊髓组织。

2.2 新生期

分别选取出生后第1天、第3天和第7天的SD新生鼠，置于冰块上，经4%多聚甲醛进行全身灌注固定，剪取一段脊柱4%多聚甲醛固定2h后，在体视显微镜下用眼科剪和眼科镊剥离出脊柱中的脊髓组织。上述两种脊髓组织在包埋前采用10%蔗糖、20%蔗糖、30%蔗糖梯度脱水。脱水完成后再进行OCT包埋。

2.3 胚胎期

分别麻醉孕15天、孕17天和孕19天的SD孕鼠，麻醉下取出子宫，剪开子宫取出胚胎，然后在体视显微镜下用眼科剪取胎鼠的一段脊柱组织，取中间一段长度为1.5cm的脊柱，此时并不剔除脊柱上的骨骼和肌肉组织，用该段脊柱代替研究所需的脊髓组织直接进行OCT包埋。

3 免疫荧光染色

上述脊髓组织在恒冷箱内连续切片，切片厚度12μm。染色前，胚胎期脊髓组织还需4℃丙酮固定10min后，方可进入染色程序。已固定的组织可直接进入染色程序，染色前PBS洗3次，2min/次。常规处理后，用血清封闭，之后即可滴加小鼠抗EGFR一抗（1∶200; Cell Signaling）4℃孵育过夜，次日滴加TRITC标记的羊抗小鼠二抗，室温避光孵育2h后荧光显微镜观察。对照染色均用PBS代替一抗。

关键词是论文的核心是作者对文章主题进行精炼之后得到的结果，有着很强的代表性[3]。研究领域的热点，通常可以用频次高的关键词来确定并且中心性超过0.1的关键词，则被认为具有较强的影响力，通过该点展开的研究较多[4]。由于不同的人对同一内容有不同的理解方式，导致命名的关键词不一致[5]。因此，本研究将含义相同、相近或存在包含与被包含关系的关键词进行合并最后重新运行软件，得到图2。高中心性关键词(＞=0.1)有大鼠、肿瘤、护理、糖尿病、教育、教学、慢性肝病、帕金森病、凋亡、治疗、糖尿病、肾病、小鼠十二个高中心度词。

4 Western-blot分析

首先提取脊髓组织蛋白，并用BCA蛋白浓度测定法对提取的脊髓组织进行蛋白浓度的测定。取蛋白上样进行SDS-PAGE电泳、转膜后然后，利用Western-blot检测EGFR、mTOR、磷酸化Akt和磷酸化mTOR表达。一抗：兔抗EGFR（1∶500；Cell Signaling Technology），兔抗 mTOR （1∶200；Abcam），兔抗p-AktS473（1∶200；eBioscience）和兔抗 p-mTORS2448(1∶300；Cell Signaling)。二抗：HRP标记的羊抗兔IgG (1∶1000；Santa Cruz) 。采用HRPECL化学发光法进行显色（参照BeyoECL显色试剂盒说明书，碧云天P0018A），利用Tanon3500凝胶图像分析系统对电泳结果进行拍照，最后用软件Bandscan 5.0 分析电泳图片，计算目的蛋白和内参β-actin的比值作为目标蛋白的相对含量值进行比较分析。

5 RT-PCR检测

目的基因引物由上海生工公司合成，引物序列如下：EGFR（ P15- TCGGTGCTGTGCGATTTA-3, P25-TGGTGGGCAGGTGTGAT-3，产物大小365bp）；mTOR（P15-CGGGATACTCACGATGGA-3，P25-AACTCCCA AGAGCACCTGTC-3 ，产物大小426bp）；内参GAPDH 140bp。引物离心后用0.2%DEPC处理水稀释至所需浓度，-20℃保存。按照一步法RT-PCR试剂盒要求进行目的基因的检测，基本过程如下：首先将RNA模板、引物、试剂盒内的物品置于冰上。依次将各反应成分加入PCR管中（反应体系25µl，成分如下：RNase-free water 13µl ；5×Buffer 5µl；dNTP Mix 1µl；Primer各 2µl；Enzyme Mix 1µl；Template RNA 1µl）。最后将PCR管放入已经预热的PCR热循环仪中，按以下程序进行RT-PCR： reverse transcription 50℃，30min；initial PCR activation step 95℃，15min；3-step cycling： denaturation 94℃，60s、annealing 52℃，45s、extension 72℃，60s； 30 cycles； final extension 72℃，10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上可观察电泳带及其位置，并用相机拍照记录电泳结果。利用软件Bandscan 5.0分析电泳图片。 计算目的基因 和内参GAPDH的比值作为目的基因的相对含量值进行比较分析。

6 统计学分析

结 果

1 不同发育阶段脊髓组织中EGFR的表达

EGFR蛋白在胚胎期表达要高于新生期和成熟期，并且在胚胎期呈现发育相关性增强，在出生前E19这一天表达到达最高峰。在新生期EGFR的表达逐渐开始下降，至成熟期时EGFR的表达为3个时期中最低，但是始终维持在一个相对稳定的水平（图1），与胚胎期表达的最高峰E19相比，出生后第3天开始各个时间点上EGFR的表达均低于E19。在基因水平上EGFR mRNA的表达与EGFR蛋白具有相似的规律，出生后第1天开始，EGFR基因的mRNA表达水平就开始显著下调，出生以后各时间点的表达水平均低于E19（图2）。免疫荧光染色显示，3个发育阶段的脊髓组织均有EGFR的表达，但是成熟期的表达明显低于胚胎期和新生期（图3）。

2 不同发育阶段脊髓组织中mTOR的表达

Western blot检测显示，mTOR水平在胚胎期最高，而随着中枢神经的发育，在新生期开始下降，成熟期后表达水平极低，几乎检测不到（图4）；不同发育阶段mTOR的mRNA的表达也发现相同的规律（图5）。由此可见，mTOR的表达与中枢神经发育进程有直接联系，其表达呈发育依赖性下调的趋势，与之对应的是脊髓组织神经元内源性生长活性也呈现出发育依赖性下调。

3 不同发育阶段脊髓组织中PI3K/Akt信号通路活性变化

图1 不同发育阶段大鼠脊髓内EGFR水平的变化。A, 代表性Western blot结果；B，EGFR相对含量的统计学分析；*：与E19比较，P＜0.05Fig. 1 EGFR level changes in rat spinal cords of different development stages. A, representative Western blot results at indicated time; B, statistical analysis for the relative amount of EGFR; *∶ P＜0.05, compared with E19

应用Western blot对胚胎期孕19天（E19）、新生期出生后第7天（N7）以及成熟期3个月龄（A3）脊髓组织p-AktS473和p-mTORS2448两种磷酸化蛋白水平检测显示，p-AktS473在胚胎期和新生期的表达量明显高于成熟期，即PI3K/Akt的信号通路在出生前活性很高，出生后则低于出生前的水平，但仍然维持相对稳定的表达状态；p-mTORS2448的表达规律为在胚胎期表达较高，而在新生期和成熟期则开始下降，尤其是在成熟期p-mTORS2448活性极低，与中枢神经元内在生长活性发育依赖性丢失的规律十分相似（图6）。由此提示，PI3K/AKt信号通路对中枢神经发育有影响，并且该影响应该与影响mTOR的活化进而改变了中枢神经元内在生长活性有关。

图2 不同发育阶段大鼠脊髓内EGFR mRNA的变化。A，代表性RT-PCR结果；B，EGFR mRNA相对含量的统计学分析；*：与E19比较，P＜0.05；#：与 N7比较，P＜0.05Fig. 2 EGFR mRNA level change in rat spinal cords of different development stages. A, representative RT-PCR results at indicated time; B, statistical analysis for the relative amount of EGFR mRNA; *∶ P＜0.05, compared with E19；#：P＜0.05 , compared with N7

图3 不同发育阶段大鼠脊髓EGFR免疫反应性的变化。A，胚胎期；B，新生期；C，成熟期；A'、B'和C'分别为A、B和C中方框的放大图象； △，EGFR免疫反应阳性神经元；比例尺：A、B和C，100μm；A'、B'和C'，50μmFig. 3 EGFR expression changes determined by immunostaining in rat spinal cords of different developmental stages. A, embryonic stage; B, newborn stage; C, adult stage; A’, B’ and C’, enlarged images of the squares in A, B, and C; △, EGFR positive neurons; scale bar, 100μm in A, B and C; 50μm in A’, B’ and C’

讨 论

表皮生长因子受体（EGFR）是一种具有配体介导酪氨酸激酶活性的多功能跨膜糖蛋白。EGF主要通过与EFGR高亲和力结合发挥作用，磷酸化的EGFR引发级联放大反应，激活下游一系列信号通路，主要包括转录因子激活有关的JAK/STAT 、丝裂原活化有关的Ras /MAPK和磷脂酰肌醇有关的PI3K/Akt等，通过这些信号通路直接参与细胞内信号转导，并在细胞生长、增殖、分化等方面发挥重要作用[7,8]。

图4 不同发育阶段大鼠脊髓组织mTOR蛋白的表达。A，代表性Western blot结果；B，mTOR相对含量的统计学分析；*：与E19比较，P＜0.05；#：与 N3比较，P＜0.05Fig. 4 mTOR level changes in rat spinal cords of different developmental stages. A, representative Western blot results at indicated time; B, statistical analysis for the relative amount of mTOR; *∶ P＜0.05, compared with E19; #∶ P＜0.05, compared with N3

图5 不同发育阶段大鼠脊髓组织mTOR mRNA的表达。A，代表性RT-PCR结果；B，mTOR mRNA相对含量的统计学分析；*：与E19比较，P＜0.05Fig. 5 mTOR mRNA level change in rat spinal cords of different developmental stages. A, Representative RT-PCR results at indicated time; B, Statistical analysis for the relative amount of mTOR mRNA; *∶ P＜0.05, compared with E19

图6 不同发育阶段大鼠脊髓内PI3K/Akt信号通路活性变化。A，代表性Western blot结果；B，p-AktS473 和p-mTORS2448相对含量的统计学分析；*：与E19比较，P＜0.05Fig. 6 PI3K/Akt signal pathway activity changes in rat spinal cords of different developmental stages. A, representative Western blot results at indicated time. B, statistical analysis for the relative amount of p-Akt and p-mTOR; *∶ P＜0.05, compared with E19

我们的研究结果显示在脊髓组织中EGFR的表达会随着大鼠神经系统的发育成熟而逐渐下调，表现出明显的发育依赖性，说明EGFR的表达确实和中枢神经的发育成熟有关。已知当配体和EGFR结合后可激活许多下游效应，如分裂、分化、生长、存活有关的信号通路，包括PKC、Ras、PI3K、MAPK等。说明EGFR对中枢神经系统的这种促发育、促生长作用应该与上述信号通路的激活有关。实验结果也证实PI3K/Akt信号通路的活性随着发育的进程再逐渐的降低，提示在中枢发育进程中，EGFR的表达与PI3K/Akt信号通路之间存在某种联系。

当EGFR表达上调并被激活形成pEGFR时，pEGFR可以导致mTOR的激活。mTOR作为PI3K/Akt信号通路的直接作用底物，是一个具有整合与细胞营养、能量、氧化等有关信息，控制细胞的生长，促进蛋白合成的关键调控点[9]，它的活性增高可以明显促进神经元的生长，而它的活性降低则无论周围环境中是否存在神经营养因子，神经元的生长都会出现障碍[3,10]。我们对EGFR的表达与信号通路PI3K/Akt的关系观察发现，不同发育阶段的脊髓组织EGFR表达水平不同，与此同时，PI3K/AKt信号通路的活化状态也随之发生改变，在出生前中枢脊髓组织EGFR表达处于较高水平时，p-Akt表达也较高，说明该通路的活性也较高。出生后EGFR表达下调时，通路的活性也随之降低，表明PI3K/Akt信号通路的活化与CNS的发育以及EGFR的表达之间具有正相关性。另外，作为Akt下游的作用底物mTOR的活性的改变也与Akt保持一致，说明EGFR介导的PI3K/AKt信号通路对神经发育进程的调控很可能是通过影响mTOR的活性来实现的[11-15]。

由此可见，脊髓组织中EGFR的表达确实和中枢神经系统的发育成熟有关，通过PI3K/AKt信号通路影响mTOR的表达可能是EGFR介导中枢神经系统内在生长活性的途径之一。

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Development-related changes of EGFR expression and PI3K/AKT/mTOR pathway activities in the rat spinal cords

Xu Mingfeng1, Zhou Hui2, Li Lu3, Hu Li3, Chen Dong3*（1Department of physiology, Guangdong Medical University,2Department of otolaryngology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,3Department of Histology and Embryology, Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524000）

ObjectiveTo explore the correlation between EGFR expression and PI3K/Akt/mTOR pathway activities in rat spinal cords of different developmental stages.MethodsEvaluated EGFR expression and PI3K/Akt/mTOR activities by immunofluorescence, western blot and PCR in embryo, newborn, and adult rat spinal cord tissues.ResultsDuring the development of nervous system,the EGFR expression level reached its peak before birth, declined gradually afterwards and maintained at a low level upon maturation.Both PI3K/Akt activities and mTOR expression increased prior to birth. The pathway activities reduced in parallel to EGFR changes after birth.ConclusionThe activities of PI3K/AKT signaling pathway in spinal cord tissues likely correlated with the maturity of central nervous system. Decreased PI3K/AKT/mTOR pathway activities, which possibly resulted from the downregulation of EGFR,may be one of reasons for the loss of intrinsic growth-dependent development in central neurons system.

PI3K/Akt pathway; neural development; EGFR

R573

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 001

2017-05-02

2017-09-18

广东医学院博士人员科研启动项目(2XB14018)

徐明锋，男（1978年），博士，讲师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：849061851@qq.com