BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型的建立及其鉴定

张 萍，李 琛，郑铭喆，张 华，季延红 （西安交通大学医学部基础医学院病原生物学和免疫学系，陕西西安710061）

BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型的建立及其鉴定

张 萍，李 琛，郑铭喆，张 华，季延红 （西安交通大学医学部基础医学院病原生物学和免疫学系，陕西西安710061）

目的：建立BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型，为研究白血病的发病机制和药物开发提供理想的平台.方法：利用含有pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒上清感染6～10周龄C57BL/6供者小鼠的骨髓细胞，移植给致死量射线照射的同种同型受者小鼠，建立BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型；监测移植小鼠的体质量，生存率；流式细胞仪检测小鼠外周血有核细胞GFP表达（代表有核细胞表达BCR/ABL1）和细胞分型；观察小鼠脾脏、肺脏和肝脏等器官大体形态和HE染色变化.结果：移植20 d后，移植小鼠呈现弓背、活动性减少、精神萎靡的状态，体质量明显降低；流式细胞仪检测外周血中出现GFP＋细胞，并且随着移植时间的延长，GFP＋粒细胞明显增多.移植小鼠的生存率较对照组明显降低.移植小鼠发病后呈现脾脏显著增大、肺出血、肺脏及肝脏出现白色结节和HE染色呈现大量细胞浸润，且小鼠脾脏中有核细胞的80%为GFP＋Gr⁃1＋细胞，即BCR-ABL1＋粒细胞白血病细胞.结论：利用此方法成功建立了BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型，为研究慢性粒细胞白血病机制和治疗提供了平台.

BCR-ABL1＋粒细胞白血病；BCR-ABL1；小鼠；生存率；逆转录病毒载体

0 引言

慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种以粒细胞失去分化能力，过度增殖为特征的骨髓增生性疾病，是一种伴有t（9；22）（q34；q11）染色体易位的恶性增生性疾病［1］.该易位染色体由位于9号染色体的原癌基因ABL1部分序列从其正常位置易位至22号染色体的BCR区（breakpoint cluster region，BCR）形成［2］，其编码的蛋白具有高度异常酪氨酸激酶活性，造成了CML细胞对酪氨酸激酶抑制剂的抵抗［3］.因此，研究CML的发病机制和治疗药物显得尤为重要，而一个良好的实验平台是研究机制和药理的基础.研究［4－5］发现，虽然我们可以利用将CML患者的白血病细胞移植给NOD/SCID小鼠构建的小鼠模型来研究白血病细胞是否导致并维持了CML，但是这种模型不能造成致死性CML且耗时较长；而BCR-ABL转基因小鼠模型由于不能完全发展成为髓系增生性疾病且具有潜伏期长的局限性，不利于治疗药物的研究［4－5］.逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型则是一种稳定高效的诱导方式［6］，可以为研究CML的发病机制和治疗药物提供帮助.本研究在逆转录病毒感染骨髓细胞移植模型的基础上建立了更加省时、高效且易于监测病程和鉴定疾病类型的方式，成功建立了容易监测及鉴定的BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型，为CML的机制和药物研究提供了一个良好的平台.

1 资料和方法

1.1 材料

1.1.1 载体和试剂 pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP、pkat⁃ampac逆转录病毒包装载体由本实验室保存.5⁃Fluorouracil（5⁃Fu，Cat＃6627）、HEPES和polybrene来自Sigma.抗小鼠Gr⁃1⁃APC（Cat＃553129）流式抗体来自BD.SCF、IL⁃3、IL⁃6来自Peprotech.

1.1.2 实验动物 6～10周龄的C57BL/6小鼠购买并饲养于西安交通大学医学部SPF级动物房.

1.2 方法

1.2.1 pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒的制备 用293T细胞培养基（DMEM培养液含有10%FBS、1%青链霉素，200 mM谷氨酸和1%MEM non⁃essential氨基酸）将293T细胞于10 cm培养皿培养至密度为80%时，利用pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒载体转染293T细胞，48 h后收集pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒上清液立即使用或储存－80℃.

1.2.2 采集和体外培养供者小鼠骨髓细胞 要求供者和受者小鼠属于同一品系.通常情况下，10只供者小鼠可提供2～3×107骨髓细胞.第1天，取6～10周龄SPF级C57BL/6小鼠20只，尾静脉注射0.6 mL 5⁃Fu/只，按200 mg/kg计算.第4天时，处死小鼠获取4～6×107骨髓细胞，将供者骨髓细胞分为两等分，即实验组和对照组，用48 mL骨髓细胞刺激培养基（含有77%DMEM，20%FBS，1%青链霉素，200 mM谷氨酸，18 ng/mL小鼠重组IL⁃3，20 ng/mL小鼠重组IL⁃6以及100 ng/mL小鼠重组SCF）分别悬于两个六孔板中，在CO2培养箱内培养24 h.

1.2.3 pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒感染供者小鼠骨髓细胞 第5天，向实验组的六孔板加入pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒第一次转染骨髓细胞培养基（含有50%pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒上清，18 ng/mL小鼠重组IL⁃3，20 ng/mL小鼠重组IL⁃6，100 ng/mL小鼠重组SCF，1%HEPES和20μg/mL polybrene），每孔2 mL，对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2 mL，轻柔混匀后，室温2300 rpm离心90 min，继续在CO2培养箱中培养3～4 h.室温下1500 rpm离心10 min，丢弃上清液，各加入24 mL骨髓细胞刺激培养基，过夜培养.第6天，向实验组的六孔板加入pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒第二次转染骨髓细胞培养基（含有50%pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒上清，18 ng/mL小鼠重组IL⁃3，20 ng/mL小鼠重组IL⁃6，100 ng/mL小鼠重组SCF，1%HEPES和20 μg/mL polybrene），每孔2 mL，悬浮第一次转染后的骨髓细胞，向对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2 mL，轻柔混匀后，室温2300 rpm离心90 min，CO2培养箱培养3 h.最后用Hank's缓冲液悬浮两组骨髓细胞，准备注射受者小鼠.

1.2.4 致死量射线照射受者小鼠并进行骨髓移植第6天，采用医用电子直线加速器（英国Eiekta）照射6～10周龄SPF级的C57BL/6小鼠12只，辐射剂量920 cGy.将上述pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为实验组，同样，将未使用逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为对照组，细胞用量为1×106/0.4 mL/只.SPF级动物房饲养移植后小鼠.每隔一天观察小鼠存活情况、称取体质量；每周采用流式细胞仪检测受者小鼠外周血GFP阳性细胞数量，即代表表达BCR-ABL1的细胞.大约15～20 d可建立BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型.

1.2.5 BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型的鉴定

1.2.5.1 移植小鼠体质量和生存率监测 每隔一天称取并记录实验组小鼠和对照组小鼠的体质量，计算实验组小鼠和对照组小鼠的生存率.

1.2.5.2 流式细胞仪检测 每周取移植受者小鼠内眦血于抗凝剂中，经红细胞裂解液裂解8 min去掉红细胞后，1×PBS洗2次，检测外周血有核细胞中GFP＋白血病细胞的百分比并计数.将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠脾脏，尽快收集病鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，经红细胞裂解液裂解5 min去掉红细胞后，1×PBS洗2次，利用抗小鼠Gr⁃1抗体对移植受者小鼠的骨髓和脾脏细胞避光孵育20 min，1×PBS洗2次，1×PBS悬起后流式细胞仪检测进行免疫分型.以Gr⁃1＋GFP＋表示粒细胞白血病细胞.

1.2.5.3 移植受者小鼠肺脏和肝脏HE染色 将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠肺脏和肝脏，将肺脏和肝脏组织标本经石蜡包埋，切片和HE染色后，显微镜下观察白血病细胞的浸润情况.

2 结果

2.1 移植小鼠体质量和生存率变化将pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP逆转录病毒感染后的C57BL/6供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给受照射后的C57BL/6受者小鼠作为实验组，以接受同样剂量照射并移植未感染病毒的供者骨髓细胞的C57BL/6受者小鼠作为对照组，每隔一天称取体质量，监测小鼠体质量变化.由于致死量照射，移植后的C57BL/6小鼠体质量呈现照射性降低，随后在一周之内恢复体质量并且持续平稳，在移植后3周时，实验组小鼠体质量连续降低，而对照组小鼠体质量保持平稳（图1A），C57BL/6实验组小鼠与C57BL/6对照组小鼠的体质量变化比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）.实验组小鼠的生存率较对照组明显降低（图1B），3～4周时相继死去.

图1 C57BL/6骨髓移植受者小鼠的体质量及生存率

2.2 移植小鼠外周血白血病细胞监测情况C57BL/6受者小鼠接受供者的小鼠骨髓细胞后，每周取移植受者小鼠内眦血，监测受者小鼠外周血中GFP＋白血病细胞的水平.通过流式细胞仪检测后发现，C57BL/6实验组小鼠7 d后外周血中即出现GFP＋细胞（图2A），并且随着移植时间推移，GFP＋粒细胞明显增多（图2B）.至白血病细胞占外周血有核细胞80%时，小鼠迅速死亡.C57BL/6对照组小鼠外周血中始终未出现GFP＋细胞.

图2 C57BL/6实验组小鼠外周血GFP＋白血病细胞

2.3 移植小鼠粒细胞白血病建模成功骨髓移植20 d左右时，实验组小鼠呈现弓背、活动性减少、精神萎靡、进食减少的状态（图3A）.当实验组小鼠体质量连续减轻且外周血白血病细胞持续增高时，处死实验组小鼠和对照组小鼠，观察肺脏、脾脏及肝脏，发现实验组小鼠脾脏较对照组体积增大显著，且出现肉眼可见大小不一数个白色突起（图3B），实验组小鼠肺脏呈现出血、粗糙且布满白色点状结节（图3C），肝脏布满白色结节（图3D）.将肺脏和肝脏进行HE染色，观察到实验组小鼠肺脏和肝脏有大量白细胞浸润（图3E、3F）.将脾脏进行HE染色，同样观察到实验组小鼠脾脏有大量白血病细胞浸润（图3G），收集实验组小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，通过流式细胞仪检测发现脾脏中主要为大细胞（图3H），且脾脏中GFP＋细胞占有核细胞的90%（图3I），利用抗小鼠Gr⁃1抗体对实验组小鼠的骨髓和脾脏细胞进行免疫分型（以Gr⁃1＋GFP＋表示粒细胞白血病细胞），通过流式细胞仪检测发现脾脏中有核细胞的80%为GFP＋Gr⁃1＋细胞，进一步证实是BCR-ABL1＋粒细胞白血病（图3J）.

图3 C57BL/6BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型

3 讨论

CML是一种由于粒细胞大量增生却失去分化能力的髓系增生性疾病，来源于造血干细胞并且由于含有致癌基因BCR-ABL而获得增殖快速于正常造血干细胞的优势［7－8］，由于致癌基因产生的蛋白具有高度异常的酪氨酸激酶活性，持续活化其下游信号分子通路，促进了CML细胞的增殖和抗凋亡能力，造成CML细胞的恶性转化［9］.在CML进程中CML⁃BP（blastic phase）患者对酪氨酸激酶抑制性药物、异体造血干细胞移植、或者联合化疗效果均较差，死亡率极高［10］.此外，相对于CML⁃CP（chronic phase）期，CML⁃BP期基因组的复杂性和异质性均更高［11］.虽然酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼对CML的治疗有革命性的突破，但是BCR-ABL1基因的突变产生了伊马替尼的耐药问题［12－13］.因此，研究BCR-ABL1＋粒细胞白血病的发生、耐药机制以及新的药物对治疗CML至关重要.虽然我们可以利用CML细胞异体移植小鼠模型和BCR-ABL转基因小鼠模型来研究CML的发病机制，但是由于这些小鼠模型构建潜伏期较长，均不利于CML治疗药物的研究.本研究利用逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型具有稳定且潜伏期短的优势，在其基础上对照射方式进行了改进，使得照射一次性成功，耗时大大缩短，为实验过程节省了宝贵的时间；此外，本研究还利用流式细胞仪检测外周血有核细胞中GFP＋白血病细胞数来监测整个病程周期，可以准确地了解移植受者小鼠的移植成功率和病程进展，为CML治疗药物的研究提供精确的控制窗口，使得便捷地观测到药物的治疗效果成为可能.这种容易监测及鉴定的BCR-ABL1＋粒细胞白血病小鼠模型，可以为CML的机制和药物研究提供极大的帮助.

BCR-ABL1逆转录病毒感染骨髓细胞移植模型可以诱导出3种疾病：类似于CML的髓系增生性疾病，急性淋巴细胞白血病以及单核细胞性白血病，表明BCR-ABL1逆转录病毒感染后的骨髓细胞呈现出一种混乱的造血方式［14－15］.5⁃Fu为细胞周期特异性化疗药物，主要杀伤分裂期细胞，从而富集髓系多能干细胞，因此，本研究利用5⁃Fu处理供者小鼠的骨髓细胞，可以提高骨髓中髓系多能干细胞的百分比，使转染效率极大提高，然后使用粒系干细胞所需的细胞因子培养供者骨髓细胞，能够导致髓系干细胞向粒系发展，最终发展为CML小鼠模型［16］.

本研究利用细胞因子体外培养5⁃Fu处理后小鼠供者骨髓细胞，再利用BCR⁃ABL1⁃GFP逆转录病毒感染供者的骨髓细胞，并移植给致死量照射后的同种系受者小鼠，通过监测受者小鼠的体质量、生存率、流式细胞仪检测受者小鼠外周血有核细胞表达GFP的情况来判定小鼠的病程进展，简单且高效，此外，利用抗小鼠Gr⁃1抗体对发病后的受者小鼠的骨髓和脾脏细胞进行免疫分型，进一步证实了BCR-ABL1＋粒细胞白血病的小鼠模型建立成功，利用流式检测技术可以高效地监测整个建模过程，且容易判定模型类别.此外，通过观察受者小鼠脾脏和肺脏等器官，我们发现白血病细胞于肺脏和肝脏均有浸润，这显示我们的模型起源于骨髓造血干细胞且具有多器官浸润的能力，这与人的CML较为相似，可以作为较理想的CML小鼠模型，为CML治疗药物的研究提供易观测、易控制的平台，为白血病的治疗提供较大的帮助.

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EstablishmentandidentificationofBCRABL1＋myeloid leukemia mouse model

ZHANG Ping，LI Chen，ZHENG Ming-Zhe，ZHANG Hua，JI Yan-Hong
Department of Pathogenic Biology and Immunology，School of Basic Medical Sciences，Xi’an Jiaotong University Health Sci⁃ence Center，Xi’an 710061，China

AIM：To establish the BCR-ABL1＋myeloid leukemia model and provide a better platform for studying the mechanism of BCR-ABL1＋myeloid leukemia and the effect of therapeutic drugs in vivo.METHODS：The bone marrow cells from C57BL/6 donor mouse treated by 5⁃Fu were transfected with the pMSCV⁃BCR/ABL1⁃IRES⁃GFP retroviral supernatant，then transplanted into irradiated C57BL/6 recipient mice to establish the BCRABL1＋myeloid leukemia mouse model.The weight loss，morbidi⁃ty，volume of spleen and lung of transplantation mice were moni⁃tored daily for signs.The GFP expression（wihch represent BCR/ABL1 expression）in the peripheral blood nucleated cells of the recipient mice and the cell classification were detected by flow cytometry.The spleen，lungs and other organs in general form and HE staining of mice were observed.RESULTS：The recipient mice obviously lost weight 20 days after transplantation.The GFP＋leukemic cells are found in peripheral blood and the number of GFP＋leukemic cells in peripheral blood increased with time.After transplantation，the survival rate of recipient mice was significantly lower than that of the control group.The recipient mice showed a significant increase in the spleen size，and the white nodules appeared on the lung and liver，the HE staining of lung and liver presented a large number of cell infiltrates，and the 80%of nucle⁃ated cells in the mice spleen was the GFP＋Gr⁃1＋cells，namely the BCR-ABL1＋granulocyte leukemia cells.CONCLUSION：We utilize this method to establish BCR-ABL1＋myeloid leukemia mouse model successfully in order to provide a better platform for studying the mechanism of BCR-ABL1＋myeloid leukemia and the effect of therapeutic drugs in vivo.

BCR-ABL1＋myeloidleukemia；BCR-ABL1；mouse；survival rate；retroviral vector

R392.9

A

2017－07－20；接受日期：2017－08－08

国家自然科学基金面上项目（31170821，31370874，81670157）

张 萍.博士生.研究方向：V（D）J重组脱靶效应和肿瘤免疫.E⁃mail：zhangp2010＠stu.xjtu.edu.cn

季延红.博士，博导，教授.研究方向：抗体多样性机制.Tel：029⁃82655182 E⁃mail：jiyanhong＠xjtu.edu.cn

2095⁃6894（2017）10⁃31⁃04