低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响

宋岩 吴高义 王菁 陈磊 杜晓媛 邢晓涛 邹姣姣 朱国雄

基础医学研究

低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响

宋岩 吴高义 王菁 陈磊 杜晓媛 邢晓涛 邹姣姣 朱国雄

目的观察低强度脉冲超声(LIPUS)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在钛片表面成骨分化的影响。方法将体外培养的BMSCs分别接种于光滑钛表面和大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面，进行矿化诱导并实施超声干预和假刺激。于矿化诱导后3、7 d进行碱性磷酸酶(ALP)定量检测，14 d进行ALP染色观察；矿化诱导21 d后行茜素红染色；于矿化诱导14、21 d检测成骨相关基因及蛋白表达。结果矿化诱导后3、7 d超声组ALP活性较对照组高(P<0.05)，14 d超声组与对照组相比钛片表面ALP染色明显深染；茜素红染色显示，21 d后超声组的染色更明显且形成更多的矿化结节；超声组的成骨相关蛋白成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白表达增高；RT-PCR检测到成骨相关基因、ALP、成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白均有不同程度表达增高(P<0.05)。结论LIPUS可以促进光滑及SLA钛表面BMSCs的成骨分化。

低强度脉冲超声(LIPUS)； 骨髓间充质干细胞(BMSCs)； 成骨分化; 钛表面

随着口腔种植技术的发展，越来越多的焦点集中于如何缩短种植体的骨结合周期以及扩大种植修复的适应证[1-2]。低强度脉冲超声(LIPUS)是一种安全、无创的治疗手段，依靠超声波能量作用于组织，能有效起到促进组织再生修复的效果[3]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是具有多向分化潜能的干细胞，其在种植体骨结合方面扮演着重要角色[4-5]。本研究旨在探讨LIPUS作用于钛表面生长的BMSCs，观察其对BMSCs在钛表面骨向分化的影响以及不同钛表面BMSCs对超声作用的生物学行为的差异。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

Wistar大鼠(山东大学实验动物中心)，钛片(西北有色金属研究所)，低糖DMEM、DMEM/F12(Gibco，美国)，胎牛血清(Hyclone,美国)，抗坏血酸(a7631)、β甘油磷酸钠(g9422)、地塞米松(D4902，sigma， 美国)，Runx2一抗(CST，#12556)，BMP2一抗(ab6285)、Osteopontin一抗(ab91655，Abcam，英国)，碱性磷酸酶测定试剂盒(A059-2，南京建成)，碱性磷酸酶(碧云天)，茜素红(索莱宝)，超声治疗仪(Cosmogamma US13)，扫描电镜(S-4800，日立，日本)，体式显微镜(SMZ745T，尼康，日本)，酶标仪(Thermo scientific，美国)等。

1.2 试验方法

1.2.1 BMSCs提取和原代培养 选用70～80 g左右wistar大鼠，过量水合氯醛处死，取其股骨并剔除肌肉组织，减去两侧骨骺，PBS冲洗骨髓腔，加入10%血清和1%双抗的低糖DMEM培养基，放入37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，3 d换液1 次，10 d左右传代。

1.2.2 BMSCs成骨诱导 配制含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸的成骨诱导剂，加入含10%血清和1%双抗的DMEM/F12培养基。取P3代细胞以2×104/ml的密度接种细胞，接种2 d后加入成骨诱导培养基，3 d换液1 次。

1.2.3 钛试件的制备和观察 将钛片切割成10 mm×10 mm×1.0 mm和20 mm×20 mm×1.0 mm的样本，20 mm×20 mm×1.0 mm试件用于RT-PCR和Western blot实验，其他实验使用10 mm×10 mm×1.0 mm试件，光滑钛表面试件使用碳化硅砂纸逐级抛光至1 500目。用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗 10 min，干燥。大颗粒喷砂酸蚀钛表面在以上处理后，使用笔式喷砂机和250 μm粒度氧化铝对钛试件喷砂，清洗后置入酸蚀液(180 ml/L HCl：490 ml/L H2SO4=1∶1)中，80 ℃下酸蚀30 min，清洗，干燥。扫描电镜观察钛表面。

1.2.4 LIPUS处理 将试件分为4 组(n=5)，光滑钛表面组(FLAT组)、光滑钛表面超声组(Flat/LIPUS组)、大颗粒喷砂钛表面组(SLA组)、大颗粒喷砂钛超声组(SLA/LIPUS组)在成骨诱导后行超声刺激或假刺激。超声强度：100 mW/cm2，频率：1.0 MHz，空占比：10%，作用时间：10 min/d。

1.2.5 碱性磷酸酶(ALP)活性检测 P3代细胞以2×104/ml的密度接种于钛试件，成骨诱导后超声干预，诱导3、7 d后吸取培养液，离心后取上清加入检测试剂，酶标仪520 nm检测吸光度A值，根据计算公式计算ALP活性(金氏单位/100 ml)=(测定A值-空白A值)/(标准A值-空白A值)×酚标准品浓度(0.02 mg/ml)×100 ml×样品测定前稀释倍数。

1.2.6 ALP染色 细胞培养和超声处理同前，14 d终止培养，PBS清洗后4%多聚甲醛固定，根据说明书加入染色液，避光孵育1 h，蒸馏水洗涤，体式显微镜观察。

1.2.7 茜素红染色 细胞培养和超声处理同前，21 d终止培养，PBS清洗后4%多聚甲醛固定，加入0.1%茜素红溶液，37 ℃孵育3 h，清洗后置于体式显微镜观察。

1.2.8 Western blot 细胞培养和超声处理同前，分别于14 d和21 d终止培养后提取总蛋白，测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，配制SDS-PAGE，上样后电泳，电泳完毕将蛋白转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，孵育二抗1 h，显色，拍照。

1.2.9 RT-PCR 细胞培养和超声处理同前，分别于14 d和21 d终止培养，使用Trizol法提取RNA，测量RNA浓度，反转录后进行PCR反应，反应温度为95 ℃，40 个周期，反应结束数据导入Graph Pad Prism 5。引物见表 1。

表 1 引物序列列表

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析，组间比较进行方差齐性检验，然后进行方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs形态学观察

骨髓间充质干细胞在原代早期呈鸟嘴形和短梭形为主(图 1A)，在细胞增殖后细胞逐渐呈长梭形并呈旋涡状生长。在传代后细胞形态逐渐稳定，细胞均一性高，背景干净(图 1B)。

A: 原代BMSCs; B: 第3代BMSCs

2.2 钛试件SEM观察

光滑钛表面在扫描电镜下观察表面呈微米级沟纹结构(图 2A)，大颗粒喷砂钛表面表面呈大小不等的微孔结构(图 2B)。

2.3 ALP活性检测

在成骨诱导3 d和7 d，培养液上清行ALP活性检测，在诱导3 d时SLA/LIPUS组中活性升高趋势明显(P<0.01)。在诱导7 d时超声组ALP活性较对照组均有明显升高(P<0.05)(图 3)。

A: 光滑钛表面; B: 大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面

图 2 钛试件表面特征(SEM)

A: Flat surface; B: SLA treated surface

Fig 2 The surface characteristics of titanium specimens (SEM)

图 3 ALP定量检测

2.4 ALP染色观察

成骨诱导2 周后ALP染色，在经过超声处理后，实验组较对照组均有更深的染色(图 4)。

图 4 成骨诱导2 周ALP染色

2.5 茜素红染色

成骨诱导3 周后茜素红染色，Flat/LIPUS组较Flat组的染色更深，出现更多的矿化结节(图 5)。在SLA/LIPUS组的茜素红染色较SLA组颜色更深。

图 5 成骨诱导3 周茜素红染色

2.6 Western Blot结果

分别于成骨诱导2 周和3 周提取总蛋白进行western blot检测，OPN、BMP2、Runx2的实验组较对照组均有明显变化(图 6)。

图 6 成骨诱导2 周和3 周western blot结果

Fig 6 Results of western blot after osteogenic induction for 2 and 3 weeks

2.7 RT-PCR结果

ALP基因在成骨诱导2 周时，LIPUS组较对照组表达增高(P<0.05)，显示在诱导3 周时，FLAT/LIPUS组较FLAT组基因表达降低(P<0.05)。OCN基因在诱导2 周和3 周时LIPUS组较对照组增高(P<0.05)，FLAT/LIPUS组在诱导3 周时尤为明显(P<0.01)。OPN基因在诱导2周和3周时LIPUS组较对照组增高(P<0.05)，FLAT/LIPUS组在诱导3 周时OPN增高明显(P<0.01)。在诱导2 周和3 周后BMP2基因表达LIPUS组较对照组增高(P<0.05),在成骨诱导2 周时，LIPUS组Runx2表达高于对照组(P<0.05)，诱导3 周时FLAT/LIPUS组基因表达较Flat组表达升高(P<0.05)。Col-1基因在成骨诱导2 周和3 周时，LIPUS组较对照组明显增高，尤其FLAT/LIPUS组较Flat组升高更为明显。LIPUS组较对照组Col-1基因表达明显升高(P<0.01)(图 7)。

3 讨 论

超声是一种安全、无创的治疗方法，大量的动物和临床研究研究表明频率为0.5～1.5 MHz，强度为30～200 mW/m2的超声干预会促进骨组织的愈合、骨沉积和生长[6-7]。以往的研究发现，超声刺激能上调间BMSCs中成骨标志物和骨基质蛋白的表达，增加成骨细胞的形成。钛具有良好的生物相容性和良好的机械性能，被广泛应用于种植体的制造，机械抛光表面和大颗粒喷砂酸蚀表面是目前应用广泛的钛表面。Liu等[8]在新西兰兔植入植体后使用超声干预，结果显示超声缩短了骨结合出现的时间并形成更成熟的骨组织。Wu等[9]在放射性骨髓炎犬模型上植入植体并行超声刺激后发现了类似的结果。Ganzorig等[10]在细胞实验中发现，超声放射可以增加不同金属材料上成骨前体细胞ALP的分泌。

图 7 成骨诱导2 周和3 周成骨相关基因的表达

Fig 7 Expression of osteogenic related genes after osteogenic induction for 2 and 3 weeks

本实验中使用超声对钛表面上生长的BMSCs进行干预，观察其对成骨分化的影响。ALP在细胞成为前成骨细胞和成骨细胞时出现，ALP活性被作为成骨细胞分化的标记[11]。本实验对ALP活性以及ALP基因的表达进行检测，并进行染色观察，发现超声组ALP活性相比于参照组有明显增高。但在21 d时，RT-PCR显示超声组较对照组表达呈降低趋势，因为ALP是成骨早期的代表标记，在骨成熟矿化期，由于基质中骨钙素等与羟磷灰石沉积相关的基因表达增加，ALP活性下降。所以猜测实验组的成骨成熟ALP下降。在21 d的茜素红染色实验证实了这一猜想，超声组茜素红深染且出现更多的矿化结节，而细胞矿化是新生骨生成的重要标志。

OCN和OPN作为非胶原蛋白是成熟成骨细胞的标志，OCN分泌到细胞外基质中与钙磷离子结合形成羟基磷灰石，OPN蛋白在细胞黏附和矿化中起重要作用[12-13]，在RT-PCR检测中，超声组OCN和OPN表达增强，在21 d时，超声组OCN和OPN表达增强趋势尤为明显。在Western blot检测中OPN蛋白的表达与RT-PCR的结果相吻合。BMP-2属于TGF-β超家族，可以通过激活BMP/Smad信号通路引起下游Runx2的表达[14]。研究中超声组BMP-2和RUNx2表达均成上升趋势，尤其Runx2在14 d时表达增强趋势明显，而21 d时较14 d时趋势下降但仍然高于对照组。Col-1在成骨细胞表型的发展和平衡中起重要作用，它可以促进种植体与骨组织的整合，其含量反映了骨成熟程度，在RT-PCR检测显示超声组Col-1表达较对照组升高明显。

在本实验中选用2 种钛表面，LIPUS对2 种钛表面促进成骨方面未见明显差异，但SLA表面相比于光滑钛表面，早期矿化及成骨相关指标均高。研究表明钛材表面的微结构可以增加成骨相关因子的分泌并增加成骨相关蛋白和基因的表达[15-17]。本实验结果与之前研究结果相同，而SLA组在超声刺激下成骨相关因素的增长率普遍比光滑钛表面高，我们认为是SLA钛表面的微结构增加了材料表面积，从而增加了对超声刺激能量的吸收。

通过LIPUS对钛表面生长的BMSCs的早期和后期矿化的影响，发现LIPUS可以促进BMSCs在钛表面的成骨分化，缩短分化时间，为LIPUS应用于种植治疗领域，缩短治疗时间，提高不良种植病例的种植成功率提供基础理论。

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TheeffectsoflowintensitypulsedultrasoundontheosteogeneticdifferentiationofBMSCsontitaniumwithdifferentsurfacetopography

SONGYan1,WUGaoyi2,WANGJing2,CHENLei2,DUXiaoyuan3,XINGXiaotao1,ZOUJiaojiao1,ZHUGuoxiong2.

1. 250000,JinzhouMedicalUniversityPostgraduateCultureBaseinGeneralHospitalofJinanMilitaryCommand,China; 2.DepartmentofStomatology,JinanGeneralMilitaryHospital; 3.DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity

Objective: To observe the effects of low intensity pulsed ultrasound(LIPUS) on the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on titanium surface.MethodsBMSCs from Wistar rat bone marrow were respectively cultured on the flat titanium surface and the large grain blast acid etched(SLA) titanium surface, and induced by mineralization medium. Then, the cells were interfered by LIPUS and a control condition. Alkaline phosphatase(ALP) were quantitative determinated after 3 and 7 d mineralization induction respectively, ALP staining were observed after 14 d induction. Alizarin red staining were observed after 21 d mineralization induction. Osteogenic related protein and gene expressions were detected after mineralization induction.ResultsALP in culture medium of LIPUS group was higher than that of the control group after 3 d and 7 d mineralization induction(P<0.05). LIPUS group showed stronger ALP staining and alizarin staining, and more mineralized nodules than control group. The expression of osteogenic related proteins, including Runx2, BMP2, OPN in LIPUS group increased. Osteogenic related genes expression, including ALP, Runx2, BMP2, OPN, OCN and Col-1 of the LIPUS group increased.ConclusionThe osteogenic differentiation of BMSCs on the flat titanium surface or SLA titanium surface can be promoted by LIPUS.

LowintensityPulseultrasound(LIPUS);Bonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs);Osteogeneticdifferentiation；Titaniumsurface

国家自然科学基金(编号： 61471384， 81400573)； 全军卫生孵育计划(编号： 15QNP019)； 山东省科技发展计划(编号： 2014GSF118101)； 济南市青年科技明星计划(编号： 2013032)

250000， 锦州医科大学济南军区总医院研究生培养基地(宋岩 邢晓涛 邹姣姣)； 济南军区总医院口腔科(吴高义 王菁 陈磊 朱国雄)； 锦州医科大学附属第一医院病理科(杜晓媛)

朱国雄 E-mail: jnjqzgx@163.com

R329.28

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.001

(收稿： 2016-12-21 修回： 2017-01-13)