高效液相色谱串联质谱法检测阿胶枣中的阿胶成分

周法东，刘宪军，来创业，刘本发,刘丽萍,李利元

(沧州市产品质量监督检验所，河北 沧州 061001)

高效液相色谱串联质谱法检测阿胶枣中的阿胶成分

周法东，刘宪军，来创业，刘本发,刘丽萍,李利元

(沧州市产品质量监督检验所，河北 沧州 061001)

建立阿胶枣中阿胶成分的检测方法。采用胰蛋白酶对阿胶枣中阿胶中的蛋白进行酶解，利用高效液相色谱串联质谱对阿胶的特征肽段进行检测，选择电喷雾正离子(ESI+) MRM模式对阿胶的特征肽段离子m/z539.8(双电荷)→612.4和m/z539.8(双电荷)→923.8 进行检测。该方法可用于阿胶枣中阿胶的检测，最低可检出浓度为含2%阿胶的阿胶枣样品。

液质联用；阿胶枣；阿胶；特征离子峰

阿胶(Collacoriiasini)为马科动物驴(EquusasinusL.)的干皮或鲜皮经去毛熬制而成,始载于《神农本草经》,被列为补血“圣药”，主治血虚萎黄,眩晕心悸,肌痿无力,心烦不眠,虚风内动,肺燥咳嗽,痨咳咯血,吐血尿血,便血崩漏,妊娠胎漏。阿胶枣是以正宗阿胶和金丝小枣为主要原料精制而成，含多种果糖、维生素、葡萄糖、微量元素，是一种老幼皆宜的保健食品。但是目前少数一些企业标称为阿胶枣，但在加工阿胶枣的过程中少添加或没有添加阿胶甚至添加假冒伪劣的阿胶产品，导致了其产品中缺少了部分保健功效。本研究根据胶原蛋白序列差异来鉴别产品的质量差异，以期为市场监督部门提供技术依据，维护市场公平公正以及保护消费者利益[1-2]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲酸、乙腈均为色谱纯，购于赛默飞世尔科技有限公司；碳酸氢钠为分析纯，购于天津科密欧化学试剂有限公司；胰蛋白酶为序列分析纯，购于Promega公司；阿胶、黄明胶均购于东阿阿胶股份有限公司。

1.2 仪器与设备

岛津8030高效液相色谱-质谱联用仪、配备四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、恒温柱温箱、电喷雾电离源(岛津公司)；DiamonsilC18色谱柱(150mm×2.1mm，5μm) (北京迪马科技有限公司)；Milli-Q密理博超纯制水机(默克密理博公司)；M37610-33涡旋混合器(赛默飞世尔科技有限公司)；BK-80A超声波振荡器(济南巴克超声波科技有限公司)；湘智TGL21M高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

流动相流速0.3mL/min，进样量：5μL，柱温：40℃，以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25min，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40min，A 80%→50%，B 20%→50%。

1.3.2 质谱条件

电喷雾正离子 (ESI+) MRM模式；选择阿胶特征离子峰m/z539.8(双电荷)→612.4和m/z539.8(双电荷)→923.8作为监测离子对；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：540L/h。

1.3.3 阿胶枣的制备

取一定量阿胶粉碎，放入容器中加少量水，加热3～4min，待阿胶全部化开后，加入20 g量红糖搅拌，直至红糖全部溶化，接着把200 g去核金丝枣放入，加热10min，并把枣不停翻动搅拌，待浆液全部挂到枣上为止。

1.3.4 样品前处理

样品的制备，将样品放入粉碎机中绞碎，准确称取混合均匀试样约5 g(精确到0.01g)加1% 碳酸氢铵溶液40mL，超声处理30min，滤纸过滤，取滤液放入50mL比色管中，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用前现配)10μL，摇匀，37℃恒温酶解12h，即得。

对照阿胶的制备，取阿胶对照药材粉末0.1 g，放入50mL比色管中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，加1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用前现配)10μL，摇匀，37℃恒温酶解12小时，即得。[3-9]

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

首先对特征离子进行全扫描，得到特征离子的双电荷分子离子峰。以双电荷分子离子为母离子进行二级质谱采集。将二级质谱中丰度较高的2个特征离子m/z 612.4 和m/z923.8 作为检测离子对，如图1。以多反应监测(MRM)模式对传输电压和碰撞能量等进行优化。[10-11]

表1 质谱分析条件

图1 阿胶特征离子m/z539.8的二级质谱图

2.2 阴性样品和干扰性试验

用水晶蜜枣(不含阿胶成分)和黄明胶对照药材作为阴性样品，以阿胶对照药材、阿胶枣为阳性样品，选择阿胶特征分子离子峰m/z 539.8(双电荷)→612.4和m/z 539.8(双电荷)→923.8作为检测离子对进行测定，结果水晶蜜枣阴性、黄明胶样品的色谱图中，在与阿胶对照药材及阿胶枣样品相应的位置上无相应的色谱峰，认为水晶蜜枣阴性样品(不含阿胶成分)及黄明胶对阿胶枣样品测定无干扰(见图2～5)。

图2 阿胶对照品特征分子离子色谱图

图3 阿胶枣特征分子离子色谱图

图4 水晶蜜枣色谱图

图5 黄明胶特征分子离子色谱图

2.3 样品检测限的确定

按照“1.3.3”方法分别制得含0%、1%、2%、 5%、10%阿胶的阿胶枣系列，按照“1.3.4”方法进行前处理，以阿胶特征离子峰m/z 539.8 (双电荷)→612.4 和m/z 539.8(双电荷)→923.8作为检测离子对进行检测(如图6～9)所示，含2% 阿胶的阿胶枣中，特征分子离子峰的信噪比为3：1，故检测限规定为: 在MRM 模式下，最低检出浓度为含2%阿胶的阿胶枣。

图6 阿胶含量1%阿胶枣色谱图

图7 阿胶含量2%阿胶枣色谱图

图8 阿胶含量5%阿胶枣色谱图

图9 阿胶含量10%阿胶枣色谱图

2.4 方法的准确度试验

分别制备添加2%、5%、10%的阿胶枣各6份样品，按“1.3.4”方法进行前处理，分别进样，以阿胶特征离子峰m/z 539.8 (双电荷)→612.4 和m/z 539.8(双电荷)→923.8 作为检测离子对进行检测，特征离子峰峰面积的RSD如表2所示。

表2 方法准确度试验

3 结论

本文所建立的特征分子离子检测方法高效、快速，可以有效地对阿胶枣中阿胶成分进行检测。本文所的相关检测方法也可以应用于其他食品的质量控制和市场监管，对提升产品的质量维护消费者经济权益等方面也有重要意义。

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Liquidchromatographytandemmassspectrometryanalysisofdonkey-hideglueinEjiaojujube

ZHOUFa-dong,LIUXian-jun,LAIChuang-ye,LIUBen-fa,LIULi-ping,LILi-yuan

(CangzhouInstituteofProductQualitySupervisionandInspection，Cangzhou061001，China)

To establish an analytical method for identification of donkey-hide glue in Ejiao jujube.The use of trypsin gelatin Ejiao jujube in protein digestion，the use of high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry characteristics of Ejiao peptides were detected，choose positive electrospray ionization (ESI+) MRM mode characteristics of gelatin peptide ion m/z 539.8→612.4 and m/z539.8→923.8 for testing.This method can be used donkey-hide glue in Ejiao jujube detection，can be detected at a concentration of Ejiao jujube sample containing 2% donkey-hide glue in.

Liquid chromatography tandem mass spectrometry(LCMS/ MS)；Ejiao jujube；Donkey-hide glue；Characteristic ion peak

2017-08-22

河北省质量技术监督局科技计划(2012ZD11)

周法东(1958-)，男，正高级工程师，主要从事质量管理，食品检验工作.

刘宪军(1981-)，男，工程师，硕士，从事食品检验工作.E-mail: liuxianjun1981@163.com

李利元(1970-)，男，高级工程师，本科，主要化学分析，食品检验工作.

1001-9383(2017)03-0052-06

O657.63

A