鼻宁喷雾剂的HPLC指纹图谱研究Δ

王森，邱玉玲，熊永爱，欧水平，王玉和#（.遵义医学院药学院，贵州遵义563003；.遵义医学院附属医院药剂科，贵州遵义563099）

鼻宁喷雾剂的HPLC指纹图谱研究Δ

王森1＊，邱玉玲1，熊永爱1，欧水平2，王玉和2#（1.遵义医学院药学院，贵州遵义563003；2.遵义医学院附属医院药剂科，贵州遵义563099）

目的：建立鼻宁喷雾剂的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法：采用HPLC法。色谱柱为Neptune C18，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为326 nm，柱温为25℃，进样量为10 μL。以芦丁为参照，测定20批样品的HPLC图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行共有峰指认和相似度评价。结果：20批鼻宁喷雾剂的HPLC图谱有40个共有峰，相似度均＞0.9。经验证，20批样品HPLC图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。结论：该研究所建指纹图谱可为鼻宁喷雾剂的鉴别和质量评价提供参考。

鼻宁喷雾剂；高效液相色谱法；指纹图谱；芦丁

鼻宁喷雾剂是鼻科苗药品种，由鹅不食草和一枝黄花药材经水提醇沉工艺制得，具有疏风解表、清热通窍之功效，临床用于治疗急性、慢性单纯性和过敏性鼻炎等症状。鹅不食草和一枝黄花药材均为菊科植物，所含化学成分复杂，均含挥发油和黄酮类、萜类、甾醇类成分。但该品种现行标准[WS-10548（ZD-0548）-2002-2012Z]

中仅鉴别两味药材和测定芦丁的含量，难以全面综合评价其内在质量[1]。目前，各地方的鹅不食草和一枝黄花药材标准参次不齐[2-5]，几乎均仅限药材鉴别和单一成分含量测定。中药高效液相色谱（HPLC）指纹图谱能全面地反映化学成分信息，已广泛用于中药材或中成药的质量控制。因此，本试验采用HPLC法对鼻宁喷雾剂进行指纹图谱研究，以为全面有效控制该制剂的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括DAD检测器（美国Agilent公司）；BT125D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；JA1002型电子分析天平（上海浦春计量仪器有限公司）；Exceed-Cd-20型实验室超纯水机（成都艾科水处理设备有限公司）。

1.2 试剂

鼻宁喷雾剂[百花医药集团有限公司，批号：20150807、20150815、20150827、20150904、20150912、20150920、20151009、20151017、20151030、20151104、20151114、20151128、20151203、20151214、20151224、20160106、20160112、20160120、20160209、20160217（S1～S20），规格：10 mL/瓶]；绿原酸对照品（批号：110753-201415，纯度：96.2%）、芦丁对照品（批号：100080-201409，纯度：92.6%）均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：151028，纯度：98.2%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。

1.3 药材

鹅不食草、一枝黄花药材均购于贵州省毕节市玲源中药材行，经遵义医学院杨建文主任药师鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Neptune C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，10%→15%A；15～25 min，15%→20%A；25～55 min，20%→35%A；55～65 min，35%→10%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：326 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL[6-8]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液取待测成分对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成绿原酸、芦丁和异绿原酸A质量浓度分别为140.00、403.60、322.56 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取样品适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液按鼻宁喷雾剂处方和工艺分别制备缺鹅不食草、一枝黄花药材的单一阴性样品和双阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成单一阴性对照溶液和双阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20150807）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以芦丁的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，40个共有峰相对保留时间的RSD＜0.5%（n＝6），相对峰面积的RSD＜2.5%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20150807）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以芦丁的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，40个共有峰相对保留时间的RSD＜2.5%（n＝6），相对峰面积的RSD＜0.5%（n＝6），表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验精密称取同一批样品（批号：20150807）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以芦丁的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，40个共有峰相对保留时间的RSD＜0.3%（n＝6），相对峰面积的RSD＜5%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰相关分析

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成取20批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对20批样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

图1 20批样品HPLC叠加指纹图谱Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 20 batches of samples

图2 样品HPLC对照指纹图谱Fig 2 HPLC control fingerprint of sample

2.4.2 相似度分析采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对20批样品的HPLC图谱进行比较分析。结果，20批样品（S1～S20）相似度均＞0.9，表明20批样品质量稳定，详见表1。

2.4.3 共有峰相关数据分析采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对20批样品的HPLC图谱进行比较分析。结果，20批样品有40个共有峰。对比药材图谱可知，7、23号峰来源于鹅不食草药材，1～4、6、8～10、12、14、16、18～21、24、31～40号峰来源于一枝黄花药材，5、11、13、15、17、22、25～30号峰为鹅不食草和一枝黄花药材共有；对比混合对照品图谱可知，11号峰为绿原酸，22号峰为芦丁，28号峰为异绿原酸A。其中，芦丁峰面积较大且稳定，因此选择22号峰（芦丁）作为参照峰，计算其他共有峰相对于22号峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表2、表3。

3 讨论

3.1 指标成分的选择

鹅不食草和一枝黄花药材均含挥发油、黄酮类、萜类等成分，药材质量标准和相关质量研究文献报道多选择黄酮类为指标成分，如绿原酸、芦丁、异绿原酸A、槲皮素和山奈酚等[9-12]。预试验中发现样品中的槲皮素和山奈酚含量较低，故最终选择绿原酸、芦丁和异绿原酸A为指标成分。

3.2 指纹图谱分析

在本研究中，笔者共发现40个共有峰，成分归属分析表明，12种成分为鹅不食草和一枝黄花药材共有，包括选择的指标成分绿原酸、芦丁和异绿原酸A，这与鹅不食草和一枝黄花药材同属菊科植物有关。从20批样品的相似度分析结果可知，各批样品的HPLC图谱与对照指纹图谱之间的相似度良好，均＞0.9，表明不同批次鼻宁喷雾剂所含化学成分基本一致。

表1 20批样品相似度评价结果 Tab 1 Similarity evaluation of 20 batches of samples

表2 20批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间Tab 2 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms of 20 batches of samples

续表2Continued Tab 2

综上所述，本研究所建指纹图谱可为鼻宁喷雾剂的鉴别和质量评价提供参考。

表3 20批样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积Tab 3 Relative peak area of common peaks in HPLC chromatograms of 20 batches of samples

[1] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准WS-10548（ZD-0548）-2002-2012Z[S].2012.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：3、347.

[3] 贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳：贵州科技出版社，2003：4.

[4] 香港卫生计划署.香港中药材标准：第七册[S].2015：111-122.

[5] 香港卫生计划署.香港中药材标准：第六册[S].2014：755-766.

[6] 吴静，程谦凡，孙莉，等.鹅不食草中短叶老鹤草的定量方法研究[J].北方药学，2015，12（10）：8-9.

[7] Chan CO，Jin DP，Dong NP，et al.Qualitative and quantitative analysis of chemical constituents of Centipeda minima by HPLC-QTOF-MS&HPLC-DAD[J].J Pharm Biomed Anal，2016，doi：10.1016/j.jpba.2016.04.029.

[8] 贾媛，张恒玉，柴尧，等.东北地区铁线透骨草药材的HPLC指纹图谱研究[J].中国药房，2017，28（9）：1265-1267.

[9] 刘杰，王曙炎，都恒青.气象色谱法测定鼻塞通喷雾剂中乙酸菊烯酯的含量[J].药物分析杂志，2005，25（7）：840-842.

[10] 刘杰，侯惠鸣，屠万倩.鹅不食草挥发油成分的GC-MS分析[J].中草药，2002，33（9）：785-786.

[11] 茅向军，许乾丽，鲍家科，等.一枝黄花高效液相指纹图谱研究[J].中成药，2011，33（10）：1657-1659.

[12] 冯华，聂明华，王祥培，等.HPLC法同时测定一枝黄花药材中绿原酸、芦丁和山奈素的含量[J].世界科学技术：中医药现代化，2014，16（4）：904-907.

Study on HPLC Fingerprint of Bining Nasal Spray

WANG Sen1，QIU Yuling1，XIONG Yong’ai1，OU Shuiping2，WANG Yuhe2（1.School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563003，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou Zunyi 563099，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint of Bining nasal spray.METHODS：HPLC method was performed.The determination was performed on Neptune C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 326 nm，and the column temperature was 25℃.The sample size was 10 μL.Using rutin as reference，HPLC chromatograms of 20 batches of samples were determined.Common peak identification and similarity evaluation were conducted by using Similarity Evaluation System for TCM Fingerprint（2012 edition）.RESULTS：There were 40 common peaks in HPLC chromatograms of 20 batches of Bining nasal spray，with similarity＞0.9.After validation，HPLC chromatograms of 20 batches of samples were in good agreement with the control fingerprints of those.CONCLUSIONS：Established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of Bining nasal spray.

Bining nasal spray；HPLC；Fingerprint；Rutin

R927

A

1001-0408（2017）30-4278-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.30.27

贵州省科技计划项目（No.黔科合SY字〔2015〕3034）；遵义市“15851人才精英工程”科研项目（No.黔科合SY字〔2015〕3034）

＊副教授，博士。研究方向：中药外用制剂。电话：0851-28642515。E-mail：wangsen912912@126.com

#通信作者：主任药师。研究方向：医院药学。电话：0851-28609699。E-mail：1149076068@qq.com

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吉林省科技发展计划项目（No.20160204021YY）

＊讲师，硕士。研究方向：天然药物化学成分。E-mail：43253545@qq.com

#通信作者：工程师。研究方向：天然药物化学成分。E-mail：miao4596@163.com