揉髌手法对兔膝骨关节炎模型软骨组织的影响

田林++戴七一++戴子一++罗荣宇

【摘 要】目的：觀察揉髌手法对兔膝骨关节炎模型软骨组织的影响，为膝骨关节炎的防治提供实验依据。方法：将48只新西兰兔随机分为手法组、对照组、假模组、正常组，每组12只。手法组和对照组通过结扎下肢部分静脉造成骨内高压型膝骨关节炎模型；假模组行手术显露但不结扎切断相应血管；正常组则不做任何处理。自造模1周后手法组予揉髌手法，连续治疗5周，共17次，其余3组不予任何治疗措施。在造模后第12周末取右膝关节胫骨平台内侧软骨组织进行肉眼观察和切片光镜观察，并按照关节软骨改良Mankin分级评分标准进行病理学评分。结果：经软骨组织病理学Mankin评分，对照组评分与手法组、假模组及正常组比较明显较高，差异有统计学意义（P < 0.05）；手法组与假模组比较，差异无统计学意义（P = 0.99 > 0.05）。对照组呈现中度退变，手法组及假模组为轻度退变，正常组未见明显退变。结论：揉髌手法能延缓软骨组织退变。

【关键词】 骨关节炎，膝；揉髌手法；软骨组织；动物模型

Effect of Kneading Manipulation on Cartilage Tissue in Rabbit Models with Knee Osteoarthritis

TIAN Lin，DAI Qi-yi，DAI Zi-yi，LUO Rong-yu

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of kneading manipulation on the morphology of cartilage in rabbits with knee osteoarthritis，and to provide experimental basis for the prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：Forty eight New Zealand rabbits were randomly divided into a manipulation group，a control group，a sham group and a normal group，with 12 rabbits in each group.In the manipulation group and the control group，the intraosseous hypertensive knee osteoarthritis models were induced by ligation of the lower part of the vein.The sham group underwent operation without ligation and cut-off of the corresponding blood vessels；and the normal group did not receive any treatment.One week after the models were made，rabbits in the manipulation group were treated with kneading manipulation for five consecutive weeks，a total of 17 times，and the remaining three groups were not given any treatment.At the end of the twelfth week after the establishment of the models，the medial articular cartilage of the right knee joint tibial plateau was taken out and observed with naked eyes and slice light microscope，and the pathological scores were evaluated according to the improved Mankin grading standard of the articular cartilage.Results：According to Mankin scores，the scores of the control group was significantly higher than those in the manipulation group，the sham group and the normal group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The difference between the manipulation group and the sham group was not statistically significant（P = 0.99 > 0.05）.The control group showed a metaphase degeneration，while the control group and the sham group showed a mild degeneration，and there was no obvious degeneration in the normal group.Conclusion：The kneading manipulation can delay the degeneration of cartilage tissue.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；

kneading manipulation；cartilage tissue；endprint

animal model

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节软骨退变损坏、关节周围软组织炎性反应、关节边缘和软骨下骨骨质增生及半月板退变等为主要病理表现，以膝关节疼痛、活动障碍等为主要临床表现的退行性、炎症性关节疾病[1]，其中关节软骨退变是KOA主要病理表现。关节软骨是一种无神经、无血管的透明软骨组织，主要由软骨细胞和细胞外基质组成，具有抗磨损、润滑关节、传导关节负荷和缓冲震荡等功能[2-4]。作为KOA的早期病变部位，软骨的主要病理表现为软骨细胞的凋亡和细胞外基质的降解，进一步发展为软骨的进行性破坏和消耗。由此可见，保证关节软骨的结构及功能的完整性是维持膝关节正常生理功能的重要

条件。

揉髌手法是由捏拿股四头肌、旋转揉按髌骨和屈伸牵张患膝关节等手法组成，其疗效已经得到临床证实[5]。本实验通过观察揉髌手法对兔KOA模型软骨组织形态的影响，为KOA的防治提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 普通级6月龄新西兰兔48只，雌雄各半，体质量（2.75±0.25）kg，由广西中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（桂）2003-0001。

1.2 主要仪器 脱水机（ASP3005型，德国LEICA公司）；包埋机（EG1160型，德国LEICA公司）；切片机（RM2235型，德国LEICA公司）；生物组织摊片烤片机（CS-Ⅲ型，孝感亚鹏公司）；光学显微镜（CX31型，日本OLYMPUS公司）。

2 方 法

2.1 动物分组 整个实验操作过程依照我国科学实验技术部门颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》对动物实施处置[6]。实验动物饲养于广西中医药大学实验动物中心特定的兔房内，在单笼室温条件下，可于笼内自由活动，自主饮水及进食。于相同环境条件下适应性饲养1周后，将48只新西兰兔采用随机数字表法分为手法组、对照组、假模组、正常组，每组12只。

2.2 模型制备方法 本研究采用手术结扎兔右侧臀下静脉、股静脉及大隐静脉造成骨内高压型KOA模型[7-9]。手法组、对照组和假模组均应用1%戊巴比妥钠3 mL·kg-1行耳静脉麻醉，待麻醉效果良好后，手法组和对照组24只兔取左侧卧位固定于动物实验解剖台上，右侧臀部手术区去毛备皮、碘伏消毒。在髋关节大转子后1 cm处标记定位，以此为中点，纵行切开皮肤，切口长约3 cm，用弯钳对皮下组织、筋膜及肌肉进行逐层分离，彻底止血使术野清晰，充分显露髂内静脉分支臀下静脉并剥离，丝线双重结扎，结扎线间切断。取仰卧位，充分暴露右侧腹股沟，去毛备皮、消毒，在右侧腹股沟动脉搏动处定位并纵行切开皮肤，切口长约

4 cm，弯钳分离皮下组织，止血使术野暴露清晰，于股动脉搏动旁找到伴行的股静脉及大隐静脉并分离，分别双重结扎后从线间切断。依次逐层缝合皮下组织、皮肤后，敷盖酒精纱布、棉垫，并用胶带牢固固定。

假模组采用相同的体位及消毒方法，取同样的切口清晰地显露出臀下静脉、股静脉和大隐静脉，但不予结扎和切断，暴露完成后由内到外直接进行手术口缝合，酒精纱布、棉垫敷料包扎固定。

手术后手法组、对照组、假模组连续3 d给予左侧臀肌注射青霉素（5×104 U·kg-1·d-1）、链霉素（1×105 U·kg-1·d-1）预防感染，同时密切注意术口敷料覆盖情况，必要时进行术口换药包扎固定，直至术口愈合。正常组12只不做任何处理。

2.3 实验干预 手法组造模1周后使用揉髌手法进行治疗，具体操作如下：将动物置于操作台，待动物情绪稳定后由上而下捏拿兔右下肢股四头肌

3 min，然后先顺时针后逆时针旋转揉按患膝髌骨3 min，再屈伸牵张膝关节4 min。每只兔每次施术10 min，隔日1次，因手法施术的时长与力度等具有主观差异，为尽可能减小实验数据的偏倚，由专人定时施术，连续治疗5周，共17次。对照组造模后不再做其他干预处理，同时期常规饲养。假模组术后不做任何干预处理，同时期常规饲养。正常组不做任何干预处理，同时期常规饲养。

2.4 实验动物软骨组织形态观察 在第12周末采血后，全部沿耳缘静脉空气栓塞处死动物，于兔右膝關节处备皮，常规消毒，解剖右膝关节后，使用咬骨钳、手术刀取内侧胫骨平台软骨组织，固定染色，切片光镜观察，具体步骤如下：①取实验动物右膝关节内侧胫骨平台软骨约0.3 cm×0.3 cm，肉眼大体观察软骨组织的颜色、光泽及形态后，放入4%多聚甲醛溶液中固定备检。②将备检的软骨组织样本取出，经过脱钙、脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度约为3 μm，然后HE染色、封片，光学显微镜下观察并拍摄，记录各组软骨组织形态学的变化。③甲苯胺蓝染色组织样本切片脱蜡后，蒸馏水反复浸洗3次，0.1%甲苯胺蓝液浸染10 min，染色5～8 min，用蒸馏水将多余染液洗净，95%的乙醇进行Ⅰ、Ⅱ级脱水处理，然后用二甲苯由低到高的三级别透明处理，中性树胶封固，光学显微镜下观察并拍摄记录各组软骨组织形态学的变化，按照关节软骨改良Mankin分级评分准则进行病理学评分。见表1。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 关节软骨组织形态的大体观察 兔膝关节软骨肉眼观察结果见表2。

3.2 关节软骨组织形态的光镜下观察 手法组：软骨表面可见大部分深达移行层的裂隙，见图

1（1）；四层结构基本清晰。部分动物软骨层增厚，表层及中层细胞增多，并排列稍紊乱；潮线清晰完整，个别标本潮线稍模糊或出现双潮线；甲苯胺蓝染色出现轻度减退，见图2（1）。endprint

对照组：软骨表面不光滑，可见糜烂和缺损，且大部分动物可见深达辐射层，周围软骨见簇状增生明显，局灶骨赘；软骨层变薄显著，软骨厚薄不均匀，软骨细胞显著减少，见图1（2）；软骨中可见潮线扭曲紊乱，并有软骨下血管入侵潮线现象；甲苯胺蓝染色以中度减退为主，个别动物软骨呈重度减退，见图2（2）。

假模组：软骨表面裂隙不规则，部分动物软骨裂隙深达移行层，见图1（3）；软骨四层结构清晰，层次排列规则，软骨细胞数量正常；有一只兔的软骨层变薄明显，软骨细胞明显减少；大部分标本潮线清晰完整，个别标本稍模糊或出现双潮线，或软骨下血管入侵潮线现象；甲苯胺蓝染色轻度减退为主，见图2（3）。

正常组：软骨表面光滑平整，见图1（4），个别标本软骨表面见小裂隙；软骨四层结构清晰，层次排列规则，软骨细胞数量正常；大部分标本潮线清晰完整，个别标本稍模糊或出现双潮线，个别动物甲苯胺蓝染色轻度减退，见图2（4）。

3.3 关节软骨组织病理学Mankin分级评分 按照关节软骨改良Mankin分级评分准则进行病理学评分，对照组评分显著高于其他3组，差异有统计学意义（P < 0.05）；手法组与假模组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

4 讨 论

4.1 KOA动物模型的建立与选择 目前，通过实验成功复制KOA模型的方法主要有自发性动物模型、诱发性模型两类。为模仿人类下肢的生物力学特性，造模动物以大鼠、兔、山羊、狗等哺乳动物为主。自发性动物模型即让实验动物自发关节软骨退变形成自身KOA，其病理过程与人相似，是一种理想的原发性KOA模型。诱发性模型制备方法较多，主要有机械方法、关节腔注射法及外科手术法，如Videman法、Hulth及改良法、关节刻痕法等[8-10]。

根据本课题的研究目的和实验要求，结合实验干预的特点，笔者选择骨内高压造模法，通过手术破坏膝关节稳定装置、血运系统或直接损伤关节软骨组织，模拟KOA关节应力改变、微循环障碍、骨内压增加等病理改变。依据如下：首先，动物骨内高压造模方法符合人类KOA病理变化。其次，该方法具有模型稳定、成功率高等特点，有利于本实验干预措施的实施。因关节手术造模对关节结构有所破坏，而机械方法则对关节活动进行限制，二者均对手法干预有一定的影响。骨内高压造模方法无需破坏关节结构，不影响关节正常活动和手法的实施。

从动物软骨组织观察及Mankin分级评分结果看，对照组软骨组织破坏严重，Mankin分级评分高达（9.17±0.72）分，可认为软骨组织达到中度退变，手法组及假模组以轻度退变为主，正常组未见明显退变，该实验结果符合KOA软骨组织基本病理变化特点，可认为本实验造模成功，证明结扎动物下肢静脉制备骨内高压型KOA模型的方法可取。

4.2 揉髌手法对兔KOA动物模型软骨病理学的影响 软骨作为KOA的早期病变组织，主要病理表现为软骨的退变与消耗，软骨组织呈现进行性破坏和流失[11]。揉髌手法作为一种力学干预措施，在治疗KOA的过程中，膝关节周围组织承受屈伸牵张、揉按等产生的应力，经软骨基质-整合素-细胞骨架信号传导通路实现力学因素的干预，引发软骨细胞内一系列生化反应和基因组学以及代谢组学变化，有效延缓软骨细胞的退变和降解，最终改善KOA症状及关节功能[12]。

在软骨组织病理观察方面，经软骨组织的肉眼观察及光镜下观察软骨的光滑度、颜色及色泽、厚度及锐度、软骨细胞的数量、形态和层次，发现手法组和对照组呈轻、中度退变，但手法组相对较轻，二者Mankin分级评分结果也与该病理观察结果相符合。本次实验中，手法组的Mankin分级评分与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），可见揉髌手法能有效延缓关节软骨退变。值得一提的是，假模组软骨也以轻度退变为主，假模组Mankin分级评分与手法组比较，差异无统计学意义（P ﹥ 0.05），

而与正常组比较差异有统计学意义（P < 0.05），可见假模组软骨亦有轻度退变。假模组软骨的变化可能是假模组在接受手术干预后，因创伤因素影响关节组织内环境代谢改变及活动量较少等造成的，当然，亦有Mankin评分时的人为误差等客观因素的存在。

揉髌手法能延缓软骨组织退变，达到延缓KOA进展，治疗KOA的目的。但揉髌手法对软骨组织的具体作用机制仍未完全明晰，尚需进一步研究。

5 参考文献

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收稿日期：2017-04-09；修回日期：2017-06-20endprint