病原菌核酸检测技术在儿童肺炎诊断中的临床应用分析

山东省烟台毓璜顶医院（264000）柳宏波 李爱敏

社区获得性肺炎(CAP)是儿童期尤其是婴幼儿常见感染性疾病。引起CAP的病原种类繁多，有细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌、病原虫等[1][2]，传统临床上对其中细菌病原的诊断一般采用培养法，但培养法耗时较长，容易贻误病情。近年来，各种分子诊断技术在临床上得到了越来越广泛的应用，这些技术包括抗原抗体免疫技术、基于PCR的技术和环介导等温扩增技术（LAMP）等。环介导等温扩增技术是Notomi发明的一种核酸扩增技术，基于LAMP的检测方法具有检测时间短、灵敏度高和检测结果易于判读等优点，能辅助进行病原早期诊断。我们使用北京博奥晶典生物技术有限公司生产的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）对本科室2016年收治的30份病例进行了检测，并与痰细菌培养检测方法进行了对比。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集痰液样本30例，均来源于2016年收治的儿童肺炎患者。其中2岁以下的患者18例，2岁～3岁的患者4例，3岁～4岁的患者2例，4岁～5岁的患者5例，5岁～6岁的患者1例。合格的痰液要求白细胞数大于25/低倍视野且上皮细胞＜10/低倍视野，痰液收集于样本收集管内。

1.2 痰细菌学检查 采用自然咳痰法留取痰标本，对留取痰液困难患者，采用吸痰法采集痰标本。将收集的合格痰液标本按《全国临床检验操作规程》第3版进行培养和鉴定。

1.3 痰液核酸检测 使用痰液样本0.6mL，选择北京博奥晶典生物技术有限公司生产的晶芯®细菌基因组DNA提取试剂盒II（玻璃珠法）作为核酸提取试剂盒进行痰液基因组核酸的提取，使用该公司的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法）、RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和配套软件对提取的痰液核酸进行检测，使用核酸检测试剂盒能检测常见的8种呼吸道病原（肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌），大约1小时能得到检测结果。每个样本检测时，取20μL恒温扩增试剂加入34.5μL提取的核酸混合配成扩增反应液，取50μL扩增反应液加入芯片进行核酸检测。

2 结果

2.1 痰细菌学检查结果 30例患者的痰样本经过培养都得到阳性培养结果，我们选择与呼吸道病原菌8项指标一致的检测项目进行分析，其中有22例阳性培养结果，检出率为73.3%，结果见附表1。其中肺炎链球菌阳性例数最多，为11例，在样本中的检出率为36.7%；其次为肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血杆菌，各占样本的13.3%；铜绿假单胞菌的比例为10%。以上结果与2006年的一项全国性调查结果接近[3]，肺炎链球菌是肺炎患者中最主要的细菌感染源，其次为肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌的检出率较高可能是因为其在儿童临床标本中较常见，当然也不能排除定植菌和环境污染的影响[4]。

2.2 试剂盒检测结果 30例患者的痰液核酸DNA检测结果见附表2，肺炎链球菌的检出率最高，为40%，其次肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血杆菌检出率为13.3%，另检出三例铜绿假单胞菌、一例金黄色葡萄球菌。在试剂盒检出的肺炎链球菌的病例中，有9例与培养法的检测结果一致，有2例使用试剂盒检出肺炎链球菌的同时也检出肺炎克雷伯氏菌，但细菌学检查结果为肺炎克雷伯氏菌阳性；1例试剂盒同时检出肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的病例，细菌学检查结果为流感嗜血杆菌阳性；试剂盒检出的3例肺炎克雷伯氏菌阳性病例的细菌学检查结果也是肺炎克雷伯氏菌阳性；试剂盒检出的3例流感嗜血杆菌阳性病例中，有2例与细菌学检查结果一致。在试剂盒未检出的病例中，2例细菌学检查结果为肺炎链球菌，1例为肺炎克雷伯氏菌，2例为流感嗜血杆菌，3例为铜绿假单胞菌。试剂盒与细菌学检测结果的阳性符合率为77.3%（17/22）。

2.3 统计学分析 分别对两种检测方法的肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血杆菌检出情况进行统计分析（附表3、附表4、附表5）。

附表1 细菌学检查结果统计

附表2 呼吸道病原菌核酸检测试剂盒检测结果

附表3 细菌学方法和试剂盒检测肺炎链球菌结果的比较

附表4 细菌学方法和试剂盒检测肺炎克雷伯氏菌结果的比较

附表5 细菌学方法和试剂盒检测流感嗜血杆菌的结果比较

肺炎链球菌阳性符合率为81.8%，阴性符合率为84.2%，总符合率为83.3%，试剂盒检测与细菌学检测的结果一致（Kappa值=64.8%）。

肺炎克雷伯氏菌阳性符合率为75%，阴性符合率为100%，总符合率为96.7%，试剂盒检测与细菌学检测的一致性较好（Kappa值=83.9%）。

流感嗜血杆菌阳性符合率为75%，阴性符合率为96.2%，总符合率为90%，试剂盒检与细菌学检测的结果一致（Kappa值=71.6%）。

3 讨论

儿童是社区获得性肺炎的多发人群，特别是5岁以下儿童的病情常常发展迅速并且死亡率高。目前，临床上对社区获得性肺炎细菌学的诊断还主要依赖于传统的培养法，但痰液的培养耗时较长，而且由于细菌培养有定植菌和非病原菌优势生长甚至环境菌污染的可能，导致细菌学结果与病因相关性差，容易造成对患者治疗的延误。近年来，LAMP技术因其快速简便的特点，已经得到了越来越多学者和专家的推荐，LAMP技术在肺炎相关病原的检测中的应用也已经有很多报道，比如将LAMP用于肺炎衣原体检测[5]、腺病毒检测[6]、呼吸道合胞病毒检测[7]、肺炎链球菌检测[8]、肺炎常见病原菌检测等。本研究使用的试剂盒也是基于LAMP技术，且一次能对8种常见的呼吸道病原菌进行检测，能大大缩短对未知病原的检测时间，在实际使用中更具有时效性。

本研究发现，试剂盒对临床感染率较高的3种病原，肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血杆菌的检测效果较好，与传统的细菌学检测方法有较好的一致性。根据2006年的统计，这3种菌在肺炎病原体检测中的总阳性率达20%以上[4]，所以我们推荐对初诊病人使用本试剂盒进行检测，这样能在发病初期对患者进行分流。

本研究中出现了一些试剂盒检测结果与细菌学结果不符的情况，其中细菌学发现3例铜绿假单胞菌阳性结果，而试剂盒检测结果有2例为铜绿假单胞菌阳性，铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，我们推测这1例样本的痰液中铜绿假单胞菌数量过少，细菌学阳性是因为定植菌生长或环境污染造成。

使用试剂盒检测到的几例两种致病菌同时阳性的病例中，2例在检出肺炎链球菌的同时检出肺炎克雷伯氏菌，而细菌学方法只检出肺炎克雷伯氏菌阳性；1例同时检出肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的病例的细菌学检查结果为流感嗜血杆菌阳性；以上结果显示出试剂盒检测方法在混合感染病例检测中的优势，因为培养法一般只能检出一种优势生长菌，且优势生长菌可能不是真正的致病菌。

综上所述，呼吸道病原菌核酸检测技术具有较好临床适用性，能辅助我们对肺炎患者进行早期的诊断。目前，应用于临床的核酸检测产品越来越多，希望今后能有更多更好的检测试剂服务于医疗机构，促进我国医疗事业的发展。