蝙蝠葛碱在人乳腺癌MCF-7细胞对5氟尿嘧啶敏感性的研究

李红阳 孙 亮 姜 醒 苑光军 刘 艳

·基础研究·

蝙蝠葛碱在人乳腺癌MCF-7细胞对5氟尿嘧啶敏感性的研究

李红阳1孙 亮2姜 醒3苑光军3刘 艳1

目的探讨人乳腺癌MCF-7细胞受蝙蝠葛碱(Dauricine，Dau)作用后，对5氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的影响。方法分别以终浓度为2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱、50 μg/mL的5-FU、2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱和50 μg/mL的5-FU作用于人乳腺癌细胞MCF-7，运用MTT法检测细胞增殖活性，Transwell实验分析细胞的迁移，DAPI染色检测细胞的凋亡，Western blot法检测cyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。结果MTT实验结果显示联合使用阈下浓度的蝙蝠葛碱增强了5-FU对细胞增殖的抑制；Transwell实验表明联合应用阈下浓度的蝙蝠葛碱进一步加剧了5-FU对细胞迁移的抑制；DAPI染色说明联合应用阈下剂量的蝙蝠葛碱加强了5-FU对细胞凋亡的诱导，Western blot实验表明联合应用阈下浓度的蝙蝠葛碱进一步抑制了cyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。结论蝙蝠葛碱可有效增强人乳腺癌MCF-7细胞对5-FU的敏感性。

蝙蝠葛碱；5氟尿嘧啶；乳腺癌；MCF-7细胞

乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性新发癌症总数的25%[1-2]。因此，乳腺癌的防治具有重要的价值与意义。化学疗法是治疗乳腺癌的一种重要手段，5氟尿嘧啶(5-FU)是一种常见的治疗乳腺癌化疗药物，但是通过临床观察表明，乳腺癌对5-FU的耐药性越来越突出[3]。辅助药物的开发和利用为解决化疗药物的耐药性提供了途径。

蝙蝠葛碱是从北豆根的根茎中提取的生物碱[4]。蝙蝠葛碱有抗心律失常、抗脑缺血、抗肿瘤以及逆转肿瘤多药耐药性等作用[5-6]，有研究结果显示蝙蝠葛碱对人肺癌细胞QG-56、人膀胱癌细胞T24等有良好的抑制增殖作用，而且量效关系良好[7-8]，其抗肿瘤的功能与抑制NF-κB通路有关[9]，但是关于蝙蝠葛碱对于5-FU在乳腺癌中的增敏作用鲜有报道。本研究拟将阈下浓度的蝙蝠葛碱与5-FU联用，探究能否增强乳腺癌细胞对5-FU的化学敏感性，为解决5-FU临床耐药性找出可能的方法，以此提高化疗的敏感性，减少相关化疗药物的毒副反应，为进一步探讨其可能的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MCF-7细胞由中科院上海生物细胞所引进，蝙蝠葛碱购自美国Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)配成5mg/mL贮存液，-20℃冰箱保存，实验时用DMEM高糖培养基稀释；DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、青、链霉素均购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司；5氟尿嘧啶(5-FU)购自美国Sigma公司。

1.2 MCF-7的培养与分组

体外细胞培养于含10%小牛血清以及100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养液中，37℃、5% CO2培养箱内培养，细胞长至对数生长期用于实验。

第一步筛选实验每组依次加入蝙蝠葛碱至终浓度为0.6 μg/mL、1.2 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL，空白对照组不加药。第二步细胞分为四组，空白对照组不加药(Blank组)，其余三组分别加入终浓度为2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱(Dau组)、50 μg/mL的5-FU(5-FU组)、2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱和50 μg/mL的5-FU(Dau+5-FU组)。

1.3 MTT检测

取对数生长期的MCF-7细胞，配制成2×104/mL单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔200 μL于培养箱中孵育过夜后加药。第一步筛选实验分为六组，每组5个复孔，调零孔只加入PBS；空白对照组不加药物，实验组分别加入药物培养，第二步实验一共分为四组，每组5个复孔，调零孔只加入PBS；空白对照组不加药物；实验组分别加入不同浓度药物。于培养箱中孵育24 h后每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h后终止培养。吸掉孔内培养液于每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度值。计算药物对细胞的抑制率。抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。上述实验重复3次。

1.4 Transwell实验

取对数生长期的MCF-7细胞，配制成1×105/mL单细胞悬液，取200 μL加入24孔板上室中，24孔板下室培养加入500 μL含各种药物的培养液，培养24 h后，甲醛固定，结晶紫染色后拍照观察。计数5个区域取平均值。

1.5 DAPI染色

调节对数生长期的MCF-7细胞，配制成2×105/mL单细胞悬液，六孔板中每孔2 mL，待细胞贴壁时依次加入含有药物的培养基，对照组不加药。继续培养24 h后，多聚甲醛固定20 min，Tritonx-100打孔5 min，在避光条件下加入DAPI染色5 min，用400倍荧光显微镜进行凋亡形态学观察。计数有效细胞，五个区域取平均值。凋亡率(%)=(1-实验组有效细胞数/对照组有效细胞数)×100%。

1.6 Western blot检测

处于对数取生长期的MCF-7细胞，配制成1×105/mL单细胞悬液，实验组分别加入2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱(Dau-1组)、50 μg/mL的5-FU(5-FU组)、5 μg/mL的蝙蝠葛碱(Dau-2组)、2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱和50 μg/mL的5-FU(Dau-1+5-FU组)，对照组不加任何药物。按照提取蛋白-测定蛋白浓度-蛋白上样-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-蛋白检测。得到图像并分析。

1.7 统计学分析

数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验结果以均数±标准差表示，其中MTT筛选实验采用单因素方差分析，其余组采用双因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 蝙蝠葛碱联合5-FU对MCF-7细胞增殖的抑制效应

MTT筛选实验显示，2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱与空白对照组比较无明显差异，作为蝙蝠葛碱的阈下浓度(图1A)。Dau组对MCF-7细胞的抑制率为(5.12±1.23)%，与空白对照组比较对细胞增殖无明显抑制(P>0.05)；5-FU组对癌细胞的抑制率为(30.25±2.23)%，与空白对照组比较，对细胞的增殖有一定的抑制效应(P<0.05)；Dau+5-FU组对癌细胞的增殖抑制率升高为(60.25±2.25)%，与空白对照组、Dau组、5-FU组相比较，对癌细胞的增殖都有一定的抑制作用，说明阈下浓度的蝙蝠葛碱可以增强对癌细胞增殖的抑制(图1B)。

图1 MTT检测蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶作用于MCF-7细胞24 h后细胞增殖抑制率Figure 1 The inhibitory rates of proliferation were calculatod in MCF-7 cells treated with dauricine or 5-FU for 24 hNote：A.The inhibitory rate of dauricine in MCF-7 cells；B.The inhibitory rate of dauricine or 5-FU in MCF-7 cells.*P<0.05，compared to the control or 5-FU groups.

2.2 蝙蝠葛碱联合5-FU对MCF-7细胞迁移的影响

Dau组与空白对照组比较，对细胞迁移几乎没有影响；5-FU组与空白对照组比较，5-FU组对细胞的迁移有一定的抑制作用(P<0.05)；Dau+5-FU组与5-FU组相对比，两者合用比单用5-FU对细胞的迁移抑制作用大大增强，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明阈下浓度的蝙蝠葛碱可以增强对癌细胞迁移的抑制(图2)。

图2 Transwell小室检测蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶对MCF-7细胞24 h后迁移的影响Figure 2 The cell migration of dauricine or 5-FU in MCF-7 cellsNote：A.Crystal violet staining；B.The statistical results of migration.*P<0.05，compared to the control or 5-FU groups.

2.3 蝙蝠葛碱联合5-FU对MCF-7细胞凋亡率的影响

应用DAPI染色观察各组药物对细胞凋亡的影响。当培养24 h后，Dau组与空白对照组比较时，对细胞凋亡没有明显影响；当5-FU组与空白对照组比较时，5-FU组对促进细胞凋亡有一定的效果(P<0.05)；将蝙蝠葛碱与5-FU联用组与单用5-FU组比较时，对细胞诱导凋亡的能力大大增强(P<0.05)，说明阈下浓度的蝙蝠葛碱可增强对癌细胞凋亡的诱导作用(图3)。

图3 应用DAPI染色检测蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶对MCF-7细胞24 h后凋亡的影响Figure 3 Effects of dauricine or 5-FU on apoptosis of MCF-7 cells after 24 hours treatment by DAPI stainingNote：A.MCF-7 cell DAPI staining；B.The DAPI staining MCF-7 cell apoptosis rate statistics，*P<0.05.

2.4 蝙蝠葛碱对MCF-7细胞cyclinD1和Bcl-2表达的影响

Dau-1组对cyclinD1和Bcl-2的表达与对照组相对比没有明显变化，Dau-2组对基因的表达产生了较为明显的影响。共用阈下浓度的蝙蝠葛碱(Dau-1)和5-FU组使cyclinD1和Bcl-2基因表达明显下降，而单用5-FU组对其相关基因表达影响较小，共用组比单用5-FU组和Dau-2组对基因表达的抑制明显。说明2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱增强了5-FU对乳腺癌细胞相关基因的表达，使增殖相关的cyclinD1基因和抗凋亡基因Bcl-2的表达进一步下降，即通过抑制细胞增殖，诱导凋亡来实现抗肿瘤的作用(图4)。

图4 应用Western blot分析蝙蝠葛碱、5氟尿嘧啶对MCF-7细胞作用24 h后cyclinD1和Bcl-2相关蛋白的表达Figure 4 The expression of Bcl-2 and cyclin D1 in MCF-7 cells.MCF-7 cells treated with dauricine or 5-FU for 24 h.The expression of cyclin D1 and Bcl-2 protein was determined by Western blot.

3 讨论

乳腺癌是女性发病率较常见的肿瘤，其中雌激素受体(ER)阳性乳腺癌占临床所有乳腺癌的60%～65%[10]。本研究选取的MCF-7细胞是研究乳腺癌的一种经典的细胞系，其雌激素受体为阳性。而且5-FU作用于MCF-7细胞是常规的乳腺癌药物治疗模型，常用作乳腺癌抗肿瘤药物开发相关研究的一线临床药物对照，其临床毒性作用和耐药性具有典型性[11]。因此，选择MCF-7细胞系与5-FU研究乳腺癌是具有代表性和现实意义的。

乳腺癌的发生发展与肿瘤的生长、侵袭转移密切相关，本研究选择MTT实验、细胞划痕实验来模拟肿瘤的生长和转移。细胞凋亡与肿瘤发生呈负相关，对肿瘤细胞凋亡的诱导率已经成为评价抗肿瘤药物疗效的可靠指标[12]，本研究运用DAPI染色来评价药物对细胞凋亡诱导率的影响。

本研究发现2.5 μg/mL的蝙蝠葛碱对肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡没有影响，可以排除抗肿瘤效果。可以作为蝙蝠葛碱的阈下浓度。综合实验结果，发现联合应用阈下浓度(2.5 μg/mL)的蝙蝠葛碱增强了5-FU的抗肿瘤效果，这与蝙蝠葛碱增强了乳腺癌对5-FU的化疗敏感性有关。

但是蝙蝠葛碱抗乳腺癌的药理及分子靶向机制研究甚少。本研究旨在探索蝙蝠葛碱体外的抗肿瘤可能的机制，我们发现蝙蝠葛碱抑制乳腺癌细胞的增殖、转移，诱导其凋亡，进一步发现蝙蝠葛碱的抗肿瘤作用是通过抑制NF-κB相关基因的表达完成的，具体表现为使增殖相关的cyclinD1基因和抗凋亡基因Bcl-2的表达下降。NF-κB是炎症和恶性肿瘤发生发展的一个至关重要的控制因子[13]。有实验显示NF-κB有着抑制细胞增殖、迁移和新生血管的生成，介导细胞死亡等多种生理效用[14]。蝙蝠葛碱使其下游靶基因cyclinD1和Bcl-2基因表达减少，从而发挥抗肿瘤作用。

本研究结果表明开发蝙蝠葛碱作为乳腺癌的辅助治疗药物是可能的。蝙蝠葛碱作为一种已经应用于临床的抗心律失常药，其药物安全性已得到充分的证实，其作为乳腺癌的辅助治疗药物具备基本的安全条件[15-16]。但是关于蝙蝠葛碱与5-FU的交互作用鲜有报道，而且蝙蝠葛碱是一种生物碱类成分，有较好的脂溶性，具有体内摄取快、发挥疗效快等优点[16]，这为开发乳腺癌的辅助治疗药物提供了理论依据。

综上所述，本研究发现阈下浓度的蝙蝠葛碱可增强化疗药物的敏感性，为开发化疗药物的辅助用药提供了理论基础，但是开发可适用于临床的新药需要进一步的研究。

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Dauricineenhancesthesensitivityof5-fluorouracilinhumanbreastcancerMCF-7cells

LIHongyang1，SUNLiang2，JIANGXing3，YUANGuangjun3，LIUYan1

1.Department of Oncology，The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China；2.Department of Human Anatomy，Harbin Medical University；3.Jiamusi College of Heilongjiang University of Chinese Medicine

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the effect of dauricine on the sensitivity of 5-fluorouracil(5-FU)in human breast cancer MCF-7 cells.MethodsMCF-7 cells were treated with 2.5 μg/mL of dauricine，50 μg/mL of 5-FU，or 2.5 μg/mL of dauricine with 50 μg/mL of 5-FU，the cell proliferation was measured by MTT assay.The cell migration was determined by Transwell assay；The cell apoptosis was detected by DAPI staining；The expression of cyclin D1 and Bcl-2 gene was examined by Western blot.ResultsThe results showed that the combination of subthreshold concentration of dauricine enhanced the inhibitory effect of 5-FU on proliferation in MCF-7 cells.The combined use of subcutaneous concentration of dauricine further aggravated the inhibitory effect of 5-FU on cell migration.The combination of subcapsular dauricine enhanced the induction of apoptosis by 5-FU.The combination of dauricine with 5-FU could inhibit the expression of cyclin D1 and Bcl-2 protein in MCF-7 cells.ConclusionDauricine can effectively enhance the sensitivity of 5-FU in human breast cancer MCF-7 cells.

Dauricine；5-Fluorouracil；Breast cancer；MCF-7 cells

黑龙江省自然科学基金面上项目(H201464)；黑龙江省高校专项基金(003000166)

1.哈尔滨医科大学附属第四医院肿瘤内科(哈尔滨 150001)；2.哈尔滨医科大学人体解剖学教研室；3.黑龙江中医药大学佳木斯学院

李红阳，男，(1989-)，硕士研究生，从事肿瘤内科的研究。

刘艳，E-mail：1953786691@qq.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.001

(收稿：2017-01-17)