RIZ1蛋白表达与宫颈鳞状细胞癌临床病理参数及放疗敏感性的相关性研究

张云艳 刘亚琴 王 磊 张 琳 成海燕 杨姗姗

RIZ1蛋白表达与宫颈鳞状细胞癌临床病理参数及放疗敏感性的相关性研究

张云艳 刘亚琴 王 磊 张 琳 成海燕 杨姗姗

目的探讨宫颈鳞状细胞癌组织中Rb蛋白结合锌指结构基因1(RIZ1)的表达及其与宫颈癌患者临床病理参数及放疗敏感性的关系。方法采用免疫组化法观察RIZ1在159例宫颈鳞癌(Ⅱ b、Ⅲ a 期)患者及20例正常宫颈组织中的表达情况，分析RIZ1在宫颈鳞癌组织中不同组间的差异表达情况，及其与宫颈癌放疗敏感性的相关性。结果与正常宫颈组织相比，RIZ1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达水平明显下降(P<0.001)；RIZ1蛋白的表达水平与宫颈癌的放疗敏感性密切相关(P=0.012)，并与FIGO分期(P=0.004)、深肌层浸润(P=0.026)、盆腔淋巴结转移(P=0.021)以及放疗后复发(P=0.005)密切相关，Logistic回归结果提示RIZ1蛋白高表达是宫颈癌放疗敏感性的独立预测因素(P=0.045)。结论RIZ1可能参与宫颈鳞癌的发生与发展过程，并可能成为评估宫颈鳞癌放疗敏感性的候选标志物。

宫颈肿瘤；RIZ1；免疫组化；放疗敏感性

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其发病率和死亡率在世界范围内居于女性恶性肿瘤的第四位[1]。在美国，2014年宫颈癌的新增病例为12 360例，死亡病例为4 020例[2]。放射治疗是中晚期宫颈癌的主要治疗方法，也是早期宫颈癌术后辅助治疗的主要手段，然而有一部分患者放疗敏感性差，预后欠佳。研究表明肿瘤的放疗敏感性与细胞缺氧微环境、细胞周期及增殖活性、DNA损伤修复以及细胞凋亡等密切相关[3-5]。因此如何预测和提高宫颈癌的放疗敏感性，改善放疗抵抗患者的预后，已成为目前宫颈癌治疗中亟待解决的重点和难点问题。

研究发现，Rb蛋白结合锌指结构基因(Retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene，RIZ)在多种肿瘤组织中表达降低，包括卵巢癌、肝癌、结肠癌、神经胶质瘤及骨肉瘤等[6-9]，在肿瘤细胞中恢复Rb蛋白结合锌指结构基因1(RIZ1)的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，并促进凋亡。本研究拟探讨宫颈鳞状细胞癌组织中RIZ1的表达及其与宫颈癌患者临床病理参数及放疗敏感性的关系，为临床判断宫颈癌患者的放疗敏感性及预后提供了客观指标，为治疗难治性宫颈癌提供了新的治疗策略。

1 资料与方法

1.1 标本来源

研究的病例来自2012年1月—2013年6月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院妇科放疗病房住院的宫颈鳞癌患者，共159例，年龄32～72岁，平均52.4±4.8岁。临床分期为FIGO分期Ⅱb及Ⅲa 期，其中Ⅱb期63例，Ⅲa期96例。所有石蜡标本均为放疗前活检标本，病理结果均为鳞状细胞癌。所有患者均按疗程完成根治性放疗，治疗方案为以铂类药物为基础的同步放化疗。同时收集并完善患者的相关临床资料，分为放疗敏感组及放疗抵抗组。全部病例在治疗前及放疗后3个月均行MRI或CT扫描，按照国际统一标准(WHO实体瘤疗效判断标准)进行放疗后近期疗效的评价：完全缓解(CR)：所有目标病灶消失，结构基本恢复正常；部分缓解(PR)：肿瘤缩小≥50%，结构大部分恢复正常；微效(MR)：肿瘤缩小<50%，结构大部分未正常；无变化(NC)：肿瘤大小无明显缩小；进展(PD)：肿瘤增大。其中CR+PR为放疗敏感组，MR+NC+PD为放疗抵抗组。同时于病理科选取20例因子宫肌瘤行全子宫切除术的正常宫颈组织标本作为正常对照。

1.2 主要抗体

兔抗人RIZ1多克隆抗体购自美国Abcam公司(ab3790，工作浓度按1∶100 稀释)；即用型免疫组化超敏 Ultra Sensitive TM SP 试剂盒(KIT-9720)购自福州迈新生物技术公司。

1.3 免疫组化染色及结果评估

应用免疫组织化学染色SP法，石蜡切片常规68℃烤片20 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，3%H2O2孵育20 min阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次，每次5 min，置于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中煮沸20 min后自然冷却修复抗原，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加封闭血清孵育10 min，倾去血清后勿洗；滴加一抗(工作浓度1∶100稀释)，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加生物素标记的二抗，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；除去PBS液，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；DAB溶液显色；自来水充分冲洗，苏术素复染，PBS冲洗返蓝，常规梯度酒精脱水后干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；光镜下观察实验结果。应用PBS液代替一抗作为阴性对照组，其余步骤均同实验组。染色结果的评估分别由两位高级职称的病理科医生进行观察和评分，每张切片均在高倍镜下(40×10倍)随机观察10个视野，每个视野内计数100个细胞，RIZ1蛋白的染色结果以细胞的胞浆呈现淡黄色至棕褐色者为阳性，根据每张切片的阳性细胞比例以及染色强度进行半定量评分，评分标准如下：无胞浆染色评分为0(阴性)；阳性细胞<10%(染色强度为淡黄色)评分为1(弱表达)；阳性细胞≥10%且<50%(染色强度为棕黄色)评分为2(中表达)；阳性细胞≥50%(染色强度为棕褐色)评分为3分(强表达)。最终评分0～1分者为低表达；最终评分2～3分者为高表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件对相关的数据资料进行统计学分析，计数资料以频数和百分比表示，组间样本率比较采用χ2检验，宫颈癌放疗敏感性影响因素分析采用Logistics回归分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RIZ1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况

RIZ1阳性染色呈棕黄色颗粒状，定位于癌细胞的细胞浆(图1)，RIZ1在宫颈鳞癌患者中的表达率为32.7%(52/159)，而在正常宫颈组织中的表达率为85.0%(17/20)，与正常宫颈组织相比，RIZ1在宫颈鳞癌组织中的表达水平明显下降(P<0.001)(表1)。

2.2 RIZ1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达水平与临床病理参数的关系

根据WHO实体瘤疗效判断标准，将保存的宫颈癌组织标本分为放疗敏感组及放疗抵抗组，RIZ1在放疗敏感组中的表达率为37.2%(48/129)，而在放疗抵抗组中的表达率为13.3%(4/30)，RIZ1在放疗敏感组中的表达水平明显上升(P=0.012)(表2)。同时结果表明RIZ1高表达与宫颈鳞癌的FIGO分期、深肌层浸润、盆腔淋巴结转移以及放疗后复发密切相关(P<0.05)。而RIZ1的表达水平与患者年龄、血清SCC水平及肿瘤大小无关(P>0.05)(表2)。

表1 RIZ1在不同宫颈组织中的表达情况

表2 在FIGO IIb和Ⅲa期宫颈鳞癌中RIZ1的表达与临床病理学参数之间的关系

2.3 RIZ1蛋白与宫颈癌放疗敏感性的关系

对RIZ1表达水平及各个临床病理参数与宫颈癌患者放疗敏感性的关系行单因素Logistic分析，结果发现患者年龄、FIGO分期、血清SCC值、肿瘤大小及深肌层浸润与患者放疗敏感性无关(P>0.05)，而盆腔淋巴结转移(P=0.002)及RIZ1表达水平(P=0.017)与患者放疗敏感性密切相关(表3)。进一步对单因素分析中与宫颈癌患者放疗敏感性有关的参数行Logistic逐步回归分析，将患者年龄带入进行校正，结果发现RIZ1表达水平(OR=0.313，95%CI：0.101～0.974；P=0.045)是宫颈癌患者是否出现放疗抵抗的独立预测因子，即RIZ1高表达的患者出现放疗抵抗的风险降低(表3)。

表3 FIGO Ⅱb和Ⅲa期宫颈鳞癌患者发生放疗抵抗的危险因素分析

图1 免疫组化检测RIZ1在人不同宫颈组织中的表达情况(200×)Figure 1 The expression of RIZ1 protein in different cervical tissues(200×)Note：A.High RIZ1 expression in cervical squamous cell cancer tissues；B.Low RIZ1 expression in cervical squamous cell cancer tissues；C.High RIZ1 expression in nomal cervical tissues；D.Low RIZ1 expression in nomal cervical tissues.

3 讨论

Buyse等[7]在进行功能性筛选可与Rb结合的蛋白质过程中通过Rb探针分离出RIZ基因，RIZ基因可以表达两种蛋白：RIZ1蛋白(280 kDa)及其替换蛋白产物RIZ2(250 kDa)[10-11]，RIZ1定位于染色体1q36。RIZ1属于核组蛋白甲基转移酶超家族[12]，为Rb结合蛋白，其基因产物可以与Rb DNA相结合，抑制Rb基因(Retinoblastoma gene)转录，同时RIZ1蛋白可以与Rb蛋白结合参与Rb途径，进而发挥其抑制肿瘤发生发展和侵袭转移的作用[13]。

处于不同细胞周期的细胞放疗敏感性有所不同，主要原因为染色体结构和内源性cAMP含量的差异。其中处于G2期和M期的细胞放疗敏感性最高，G1期的细胞次之，而S晚期的细胞对放疗的敏感性最差。细胞受到辐射后最主要的死亡方式是凋亡，而以凋亡形式死亡的细胞在整个肿瘤的细胞群体中所占的比例越大，此肿瘤对放射的敏感程度越高。既往关于RIZ1的研究已表明RIZ1在多种肿瘤中发挥抑癌作用，可以抑制肿瘤细胞的增殖，将细胞阻滞于G2/M期，并且在诱导细胞凋亡方面发挥重要作用[6-7，14]。多数学者认为RIZ1的生物学作用是通过与p53的相互作用产生的[15-17]。在单核细胞性白血病细胞中，RIZ1基因的表达受NF-κB和Akt信号通路的调控，RIZ1基因可诱导p53表达上调[18]，通过激活p53参与细胞周期的调控，进而抑制白血病细胞的增殖。在实体瘤的研究中，研究者们发现RIZ1基因在卵巢癌及神经胶质瘤等多种肿瘤组织中表达降低，且与肿瘤的预后密切相关[8-9]。RIZ1基因的表达沉默同时存在启动子甲基化和组蛋白修饰两种机制。而DNA启动子区CpG岛甲基化是RIZ1基因表达沉默的最常见原因。用DNA甲基转移酶抑制剂处理肝癌细胞、结肠癌细胞和食管鳞状细胞，可使RIZ1重新表达，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，并诱导肿瘤细胞的凋亡[19-21]。

通过本研究发现，RIZ1在宫颈鳞癌组织中表达下调，与放疗抵抗组相比，放疗敏感组中RIZ1的表达水平升高，而且Logistics回归分析结果提示RIZ1表达水平(OR=0.313，95%CI：0.101～0.974；P=0.045)是宫颈癌患者是否出现放疗抵抗的独立预测因子，即RIZ1高表达的患者出现放疗抵抗的风险降低。因此，本研究推测RIZ1基因可通过诱导细胞周期阻滞(阻滞于G2/M期)、促进细胞凋亡，从而提高宫颈鳞癌细胞的辐射敏感性，去除其由于甲基化而发生的表达抑制，将会提高临床宫颈鳞癌的放疗疗效，为宫颈癌的临床治疗提供新的靶点。

综上所述，本研究结果提示RIZ1在宫颈鳞癌的发生发展过程中具有重要的临床意义，其过度表达预示着放疗敏感性升高，可以作为判断宫颈鳞癌放疗敏感性的潜在候选标志物，指导患者制定个体化的治疗方案，有针对性的采用常规及非常规治疗(如超分割放疗、联合化疗、使用放疗增敏剂等)，既可以提高放疗疗效、改善病人生存质量，又可以避免联合化疗对机体的损伤，减轻患者的病痛及经济负担。

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RelationshipbetweenexpressionofRIZ1andclinicopathologicalfactorsorradiosensitivityinhumancervicalsquamouscellcarcinoma

ZHANGYunyan，LIUYaqin，WANGLei，ZHANGLin，CHENGHaiyan，YANGShanshan

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveThe aim of this study was to analyze the expression of RIZ1 and its association with clinicopathological factors or radiosensitivity in cervical squamous cell carcinoma.Methods159 samples from patients with FIGO stage Ⅱ b and Ⅲ a cervical squamous cell carcinoma were collected and preserved before radiotherapy.The expression of RIZ1 in cervical squamous cell carcinoma tissues and 20 normal cervical tissues was assessed by immunohistochemistry.The relationship between the RIZ1 expression and the clinicopathological factors or radiosensitivity in cervical squamous cell carcinoma was analyzed by statistical analysis.ResultsThe expression of RIZ1 protein was down-regulated in patients with cervical cancer(P<0.001).The level of RIZ1 protein expression was close related to radiosensitivity(P=0.012)，FIGO staging(P=0.004)，deep myometrial invasion(P=0.026)，and pelvic lymph node metastasis(P=0.005).Logistic regression analysis showed that the high expression of RIZ1 protein was an independent predictor of radiosensitivity in cervical cancer(P=0.045).ConclusionRIZ1 may be involved in the occurrence and development process of cervical squamous cell carcinoma and regard as a candidate biomarker for the sensitivity in cervical squamous cell carcinoma in radiotherapy.

Cervical cancer；RIZ1；Immunohistochemistry；Radiosensitivity

黑龙江省教育厅课题(12541371)

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院(哈尔滨 150081)

张云艳，女，(1972-)，博士，主任医师，从事宫颈癌放疗增敏的相关研究。

杨姗姗，E-mail：doctor_yss@hotmail.com

R735.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.004

(收稿：2017-01-18)