甘精胰岛素外源性DNA残留量的荧光染色法检测研究

柳常青，王霞，汲生芝，公伟广，张贵民



甘精胰岛素外源性DNA残留量的荧光染色法检测研究

柳常青，王霞，汲生芝，公伟广，张贵民

273400 临沂，山东新时代药业有限公司（柳常青、王霞、汲生芝、公伟广）；276006 临沂，鲁南制药集团股份有限公司（张贵民）

甘精胰岛素是一种通过基因工程重组技术，利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物，是具有长效作用的人胰岛素类似物。该药物在皮下注射后立即聚合，溶解度降低，形成微沉淀物，使吸收、分解和作用时间延长，相当于基础胰岛素的无峰值分泌，发挥长效平稳降血糖的作用[1]。宿主细胞残留 DNA 因有潜在的致癌或传染风险，是基因工程重组产品需要严格控制的杂质。《中国药典》2015 年版收载了 2 种外源性 DNA 残留检测方法：DNA 探针杂交法和荧光染色法。DNA 探针杂交法操作周期较长，干扰因素多，重复性较差，宿主菌 DNA 的种属和质量直接影响检测结果的准确性[2]。荧光染色法是利用双链 DNA 荧光染料与双链 DNA 特异结合形成复合物，在波长 480 nm 激发下产生超强荧光信号，用荧光酶标仪在波长 520 nm 处进行检测，在一定的 DNA 浓度范围内以及荧光染料过量的情况下，荧光信号与 DNA 浓度成正比[3-4]。荧光染色法操作简单快速，不需要宿主 DNA 作为模板，能够检测出重组制品中全部 DNA 污染，因而可广泛用于重组蛋白药物残余 DNA 的检测。

由于荧光试剂盒的缓冲液 pH 值接近甘精胰岛素等电点，容易导致样品溶液浑浊进而影响检测，同时从相关文献可知胰岛素或其类似物本身可能对荧光法检测产生干扰[5-6]，本文对甘精胰岛素 DNA 检测的样品处理方法进行详细研究，并对检测方法进行了方法学验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料药 重组甘精胰岛素原料药由山东新时代药业有限公司制备，批号：D012、D013、D020、D022、D033、D034。

1.1.2 仪器 荧光酶标仪 Spectra Max ®Gemini EM 及 SoftMax Pro 软件为美国 Molecular Devices 公司产品；DK-98-1 型电热恒温水浴锅为天津市泰斯特仪器有限公司产品；Z323K 型高速冷冻离心机为德国 Hermle 公司产品。

1.1.3 实验试剂 荧光试剂盒 Quant-iTTMPicoGreenTMdsDNA assay kit 购自美国 Invitrogen 公司；PCR 级重组蛋白酶 K 购自瑞士 Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1 供试品的处理方法

1.2.1.1 供试品的直接测定 分别采用 pH 8.5、pH 8.0、pH 7.5、pH 7.0、pH 6.5 的 TE 缓冲液将甘精胰岛素配制成 1.0 mg/ml 浓度，同时在上述样品中加入等体积的10 ng/ml DNA 标准品溶液，制备加样回收样品。标准曲线采用同样 pH 制备和检测。回收率用以下公式计算：回收率（%）=（样品加入 DNA 标准品后的测定值× 2 – 样品测定值）/加入 DNA 标准品的理论值 × 100%。

1.2.1.2 样品稀释法处理 以 1.5 mg 甘精胰岛素为 1 剂量计，用 pH 8.5 的 TE 缓冲液分别配制浓度为 1.0、0.5、0.1、0.05 剂量/ml 的样品溶液，同时在上述样品中加入等体积的 10 ng/ml DNA 标准品溶液制备加样回收溶液，测定回收率。

1.2.1.3 饱和苯酚氯仿溶液抽提法 取用 pH 8.5 的 TE 缓冲液配制的 0.5 剂量/ml 的供试品 450 μl，加入饱和苯酚溶液 450 μl，剧烈振摇混匀，以 10 000 r/min 离心 10 min，转移上层液体，加入饱和苯酚溶液 450 μl 重复抽提 1 次。转移上层液体加入三氯甲烷 450 μl，剧烈振摇混匀，以10 000 r/min 离心 10 min，转移上层液体置通风橱中敞口放置 15 min 后备用。加样回收溶液制备：取用 pH 8.5 的 TE 缓冲液配制的含 0.5 剂量/ml 的供试品及特定浓度的标准 DNA 的溶液 450 μl，同法处理，测定回收率。

1.2.1.4 蛋白酶 K 消化法处理 称取适量供试品（终浓度分别为 2.0、1.0、0.5、0.1 剂量/ml），加入终浓度为50 μg/ml 的蛋白酶 K 溶液，再用 pH 8.5 的 TE 缓冲液定容至特定体积，混匀后 37 ℃保温 4 h，作为供试品进行测定。加样回收溶液制备：称取适量供试品，加入终浓度为 50 μg/ml 的蛋白酶 K 溶液和 10 ng/ml 的标准 DNA 溶液，再用 pH 8.5 的 TE 缓冲液定容至特定体积，同法处理，测定回收率。

1.2.2 DNA 标准曲线的建立 考虑到样品处理可能会导致收率偏差，标准曲线制备时，DNA 标准品也按照供试品相应处理方法处理后再进行测定。直接测定和稀释法测定时：取 DNA 标准品，用 pH 8.5 的 TE 缓冲液配成 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的标准品溶液。饱和苯酚氯仿溶液抽提：取 DNA 标准品和牛血清白蛋白溶液，用pH 8.5 的 TE 缓冲液配成牛血清白蛋白浓度均为0.8 mg/ml，DNA 标准品浓度分别是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的标准品溶液，分别用上述饱和苯酚氯仿溶液抽提法进行处理。用蛋白酶 K 处理：取 DNA 标准品和牛血清白蛋白溶液，用 pH 8.5 的 TE 缓冲液配成牛血清白蛋白浓度均为 0.8 mg/ml，DNA 标准品浓度分别是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml 的标准品溶液，分别用上述蛋白酶 K 消化法进行处理。

1.2.3 测定方法 取各方法处理的供试品溶液、供试品加样回收溶液、标准品溶液各 400 μl 于 1.5 ml 离心管中，分别加入新配置的双链 DNA 荧光染料 400 μl，混匀后，避光室温放置 5 min。取 250 μl 上述反应液于 96 孔黑色酶标板中，并做 3 个复孔。用荧光酶标仪在激发波长 480 nm、发射波长 520 nm 处测定荧光强度。以各方法处理的 TE 缓冲液作为样品空白对照。数据用SoftMax Pro 软件进行处理，进行数据分析计算。

1.2.4 方法学验证

1.2.4.1 精密度 供试品浓度为 0.5 剂量/ml，按 40 ng/ml 浓度加入标准 DNA 制备加样回收样品。重复性验证采用一批供试品平行制备 6 份样品分别测定进行。中间精密度验证采用 3 批供试品，两名实验员在不同日期分别进行4 次测定。

1.2.4.2 不同加样浓度的加样回收率 对 0.5 剂量/ml 的供试品浓度分别进行 1.25、2.5、10、40 ng/ml 浓度的标准 DNA 加样回收率测定。

1.2.4.3 不同供试品浓度的加样回收率 分别对0.5 剂量/ml、0.2 剂量/ml 和 0.1 剂量/ml 3 个供试品浓度供试品进行 40 ng/ml 的加样回收率测定。

1.2.5 供试品测定 对 6 批供试品分别进行了两次重复测定，供试品浓度 0.5 剂量/ml，精密度的回收率测定采用 DNA 标准品浓度为 10 ng/ml。

2 结果

2.1 供试品的直接测定

由于甘精胰岛素等电点在 7.0 左右，接近试剂盒中的 TE 缓冲液 pH 值 7.5，会导致样品浑浊进而可能影响 DNA 检测。因此，首先对 TE 缓冲液的 pH 值进行确定。结果表明，供试品 1.0 mg/ml 浓度时，在 pH 值低于 8.5 时样品均有不同程度的浑浊现象，10 ng/ml 的 DNA 标准品加样回收率 3 次独立实验的平均值均低于 85%，RSD 均大于 25%。pH 8.5 时样品清澈，加样回收率平均值 119%，RSD 为 15.30%，精密度有所提高但仍偏差较大。

2.2 样品稀释法

用 pH 8.5 的 TE 缓冲液将供试品稀释不同倍数分别进行测定，实验重复 3 次，结果见表 1。DNA 标准品加样浓度 10 ng/ml 时，供试品稀释后精密度有所提高，但回收率仍超出 80% ~ 115% 限度范围，无法满足实验需求，且供试品浓度越低，DNA 浓度的超标限值越低，准确定量难度越大。因此稀释法不适合本品的外源性 DNA荧光法测定。

表 1 样品稀释法的加样回收率

注：*三次实验回收率分别是 108.8%、103.0%、116.7%。

2.3 饱和苯酚氯仿溶液抽提法

0.5 剂量/ml 的供试品加入 10 ng/ml 标准DNA 3 次实验回收率平均值 82.9%，RSD 为 8.83%。加入 2.5 ng/ml 标准 DNA 3 次实验回收率平均值 103.9%，RSD 为 18.34%。说明饱和苯酚氯仿溶液抽提法在低浓度 DNA 测定时偏差较大。

2.4 蛋白酶 K 消化法

结果（表 2）显示，蛋白浓度为 2.0、1.0 剂量/ml 时，酶切完毕时仍有轻度浑浊现象，说明未完全溶解的供试品影响了酶切效果，导致加样回收率偏差较大。当供试品蛋白浓度在 0.5 剂量/ml 或更低时，样品清澈，加样回收率、精密度等均能很好地满足实验测定要求。说明供试品中甘精胰岛素确实影响荧光法的 DNA 检测，同时说明本方法采用的 pH 值 8.5 是合适的。

表 2 蛋白酶 K 消化法的加样回收率

2.5 DNA 标准曲线的建立

标准品 DNA 终浓度分别是 0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng/ml。以 3 复孔荧光读数平均值对 DNA 含量（ng/ml）做标准曲线得回归方程，见表 3。

表 3 不同处理法的标准曲线方程及线性

实验结果表明，3 种方法得到的 DNA 标准曲线在 1.25 ~ 80 ng/ml 浓度范围内2值均符合 2015 年版《中国药典》中外源性 DNA 检测荧光染色法的“相关系数应不低于 0.99”的要求，但饱和苯酚氯仿溶液抽提法线性稍差，且由加样回收实验可知在 DNA 低浓度时（2.5 ng/ml）回收率偏差较大。最终采用蛋白酶 K 消化法进行测定，并进行方法学验证。

2.6 方法学验证

2.6.1 精密度 对 6 份平行样品分别进行 40 ng/ml 浓度标准 DNA 加样回收率测定，结果见表 4。6 次测定加样回收率平均值为 98.2%，其 RSD 为 1.64%，表明该法的精密度良好，能满足实验测定要求。3 复孔读数 RSD 均小于 5%，表明仪器精密度良好。

不同实验人员在不同日期分别对 3 批样品进行 4 次测定，结果见表 5。同一实验员对同一批次的 4 次测定回收率 RSD 均小于5%，同一批次的不同人员 8 次测定回收率平均值均在 95% ~ 105% 之间，RSD 均小于 5%，方法稳定性较好。另外，3 个批次供试品的所有 24 次测定 DNA 含量均低于 1.25 ng/ml，说明供试品 DNA 含量较低。

2.6.2 不同加样浓度的回收率 测定结果见表 6。在各个加样浓度下的 3 次实验加样回收率平均值均在 80% ~ 115% 之间，RSD 均小于 10%，表明该法能准确测定供试品中 DNA 的残留量。

2.6.3 不同供试品浓度的回收率 测定结果见表 7。结果表明 3 个供试品浓度加样回收率均在 80% ~ 115% 之间，RSD 均小于 5%，方法耐用性较好。

表 4 重复性验证结果

2.7 供试品测定

对 6 个批次的甘精胰岛素原料药分别进行两次重复测定，结果见表 8。结果表明两次重复测定结果一致，重现性较好。12 次测定的 10 ng/ml 标准 DNA 回收率均在 80% ~ 115%之间，表明测定结果准确。6 批供试品测定结果均低于 1.25 ng/ml，即供试品中的残留 DNA 含量均低于 2.5 ng/剂量。

表 5 中间精密度验证结果

表 6 不同加样浓度的准确度验证结果

表 7 不同供试品浓度的准确度验证结果

表 8 供试品测定的准确度和精密度验证结果

3 讨论

由于甘精胰岛素等电点的特殊性及其对外源性 DNA 的荧光法检测存在干扰，需对试剂盒缓冲液 pH 进行筛选优化，且需配制较低浓度的供试品（如 0.5 剂量/ml 及以下）并用蛋白酶 K 处理后进行测定。由于 2015 年版《中国药典》未对重组甘精胰岛素的外源性 DNA 含量做出规定，参考其重组人胰岛素 DNA 残留量的“每一剂量不得过 10 ng”的限量规定，在 0.5 剂量/ml 供试品浓度下，DNA 超限浓度为 5 ng/ml。而本法在 DNA 含量 1.25 ~ 80 ng/ml 范围内线性良好，对超过 2.5 ng/剂量的 DNA 残留均可以准确定量。

荧光染色法是比较成熟的 DNA 检测方法，在较宽的 DNA 浓度范围内线性较好[2-3, 7]。我们后续对标准曲线进行了 6 次实验测定，直接测定法和蛋白酶 K 消化法标准曲线2一般在 0.997 以上，与文献一致。但饱和苯酚氯仿溶液抽提法的2基本在 0.988 ~ 0.995 之间波动（数据未列出）。同时，由加样回收实验可知，饱和苯酚氯仿溶液抽提法 2.5 ng/ml 标准 DNA 回收率 RSD 为 18.34%，而同样条件下用蛋白酶 K 处理时回收率 RSD 为 4.1%。推测可能是 DNA 抽提收率差异导致（尤其 DNA 浓度较低时），例如上层水相回收体积的差异，测定前溶液残留的苯酚和氯仿多少等都可能影响收率，且影响程度难以准确判断[3,8]。外源性 DNA 属于微量杂质，检测时干扰因素多，而蛋白酶 K 消化法是较成熟的样品处理方法，仅需一步操作，无需对供试品进行 DNA 抽提处理，避免抽提操作带来的误差影响检测结果可靠性。

本文在对甘精胰岛素进行蛋白酶 K 处理的基础上建立了外源性 DNA 残留量测定方法，并进行了方法学验证，其线性、准确度、精密度良好，可用于甘精胰岛素外源性 DNA 残留量的测定。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.014

山东省科技重大专项（创新型产业集群）（2015ZDJQ05001）

张贵民，Email：zhangguimin@lunan.cn

2017-05-31