非酒精性脂肪肝样本库质控体系的建立

高芳芳，王婷婷，迟毓婧，叶磊，韩影，张育军，刘玉兰



非酒精性脂肪肝样本库质控体系的建立

高芳芳，王婷婷，迟毓婧，叶磊，韩影，张育军，刘玉兰

100044，北京大学人民医院临床分子生物学研究所（高芳芳、王婷婷、迟毓婧、叶磊、韩影、张育军），消化内科（刘玉兰）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，是以肝细胞脂肪变性和脂肪蓄积为病理特征，但无过量饮酒史的临床综合征[1]。随着人们生活水平的提高，NAFLD 的发病率逐年升高。全球流行病学调查表明，成人的 NAFLD 发病率是20% ~ 33%，肥胖人群中发病率高达 75%，目前已成为一种严重威胁人类健康的常见的慢性肝病。现有研究表明脂肪肝不仅可以在数年后引起肝硬化，甚至与肝癌、结肠癌的发生发展密切相关，严重影响人们预期的寿命[2-3]。但其发病机制尚未明确，因此对其发病机制的研究就显得尤为重要。

在临床研究中，收集患者的生物样本以及保证样本质量是一项很重要的工作。虽然我们在以往样本收集的过程中投入了大量的时间、财力、人力，但是由于样本收集及后期的质控不规范，所以不可避免地造成了样本的流失、临床资料的残缺、样本存放无序等一些问题，无法满足后期的实验研究。NAFLD 样本库及质控体系在样本的采集、运输、入库、质检等各个方面都做了系统和规范化的管理[4]。自 NAFLD 生物样本库质控体系建立以来解决了 NAFLD 样本收集过程中的各种难题，以下对其建设过程及方法作一详细的报道。

1 生物样本库的建设

生物样本库建设目的是保障临床组织标本的采集、保存、使用的规范化，与国际标准接轨，根据临床研究方向，留存患者知情同意书、样本信息完整、标本取材规范合理有效、标本入库规范化档案化，为临床科研服务提供优质的、珍贵的临床生物标本[5]。

1.1 人员管理

生物样本库工作人员需经过标准化的培训，使其对样本的伦理审核、知情同意、采集、处理、贮存、注释、检索、检测、出库、运输、质量管理等工作均能胜任。并定期进行标准化操作流程、安全操作、设备使用、样本信息化管理等培训。

1.2 样本库硬件设施及环境

首先，为了满足样本贮存、处理、转运、信息保存、样本质量控制等相关需求。样本库要配备超低温冰箱、液氮罐、离心机、生物安全柜、BRADY 打印机、条码扫码枪、冰台等相关设备。

其次，为保证样本质量，超低温冰箱需不间断运行。所以样本库需配备双电路系统、空调排风、新风系统。同时样本库要进行功能分区，需设立样本接收室、样本处理间、样本贮存间、样本信息录入区域、样本质控区。为保证样本库的安全，在安全设施方面，样本库要配备超低温冰箱冷链监控系统、门禁系统、消防系统、人身安全防护设备。并对设备进行专人管理，建档受控，定期对超低温冰箱进行维护、保养，设立冰箱故障的应急预案。

1.3 信息系统

建立一套信息全面而专业化的特色样本库管理系统，对患者各类样本信息进行完善的保存及管理，是有效进行医学研究的重要方法和手段[6-7]。信息系统会记录捐献者的相关情况、样本的采集、运输、保存、使用情况，使样本资料得到完整、规范的保存。系统可以进行患者管理、冰箱管理、样本类别管理，并可进行使用者的权限设置，可查询操作者的操作痕迹，数据均可自动化备份，保证了数据的安全性。

1.4 样本的质量控制

样本的质量控制关乎整个科学研究的成败。样本库的质量管理体系，包括质量保证和质量控制，贯穿于样本库的整个运作过程。质量管理体系的实施和维护有助于样本库的长期发展，保证样本库为用户提供高质量的服务，保证科研结果的质量，因此建立质量管理体系具有重要意义[8]。为保证样本质量，在样本的取材、运输、处理、取用等过程中均要根据国际标准化 SOP 的要求进行操作。

1.5 NAFLD 生物样本的收集流程

1.5.1 样本采集前

1.5.1.1 提交取材申请 临床医生将取材申请上交至样本库，经医院伦理委员会审批合格后方可开始收集相关样本。临床医生告知样本捐献者相关事宜并与其签署知情同意书。并尊重捐献者的知情权和隐私权。

1.5.1.2 入组患者要求 为保证研究成果的质量，对入组患者做以下要求：①年龄 18 ~ 65 岁，符合 2012 年 AASLD脂肪肝诊断标准（B 超或者腹部 CT 提示脂肪肝，无饮酒史或者折合乙醇量小于 210 g/周，其中女性< 140 g/周）；②患者无大肠癌、IBD、腹泻等肠道疾病及自身免疫等重大基础疾病；③患者无肠道手术史；入组患者一周内不服用抗生素；④入组患者一周内不食用辣椒、酸奶；并配以清淡饮食（不食用肥肉、鸡肉等，每日以青菜、主食为主，配以少量精瘦肉）。

入组患者排除条件如下：①饮酒：近 2 年，男 > 30 g/d，女 > 20 g/d；②转氨酶明显升高：ALT 或 AST > 200 U/L；③伴其他肝脏疾病或肝损伤史；④严重心脑血管疾病或系统性疾病（不包括糖尿病）；⑤孕妇或备孕中。

1.5.1.3 拟定样本取材单 参考国内外流行病调查表设定样本取材单，样本取材申请单中应包括患者的姓名、性别、年龄、随访联系方式、饮酒史和饮酒量、油脂摄入史和摄入量，并检测捐献者身高、体重、腰围、臀围，由此计算出捐献者体重指数[9]。同时取材单还要记录取材样本类型、取材量、取材者、取材时间。

1.5.2 样本采集和处理 肠道菌群与 NAFLD 的发生和发展有着密不可分的关系，而 NAFLD 也会影响肠道菌群的定位和数量[10]。所以为满足后续研究的需求，在收集 NAFLD 样本时要收集血清、血浆、血细胞、肠黏膜和粪便样本。为保证样本质量，在样本取材及处理过程中要严格遵循标准化操作流程，严格控制样本取材的时间，在保证病理诊断的基础上，准确取材。血液样本处理、分装时均在生物安全柜中的低温操作台上处理，做好标记，两人合作，尽可能缩短样本处理的时间[4]。

1.5.2.1 肠黏膜样本 脂肪肝患者结肠癌发生率高，建议 40 岁以上的人群常规体检行肠镜检查。入组患者在做肠镜时，样本库人员要到场收集捐献者的肠黏膜样本，用来检测其肠道菌群的情况。为了保证肠黏膜的活性，用活检钳夹取肠黏膜样本放入 2.0 ml 冻存管，做好标记。迅速将其投入液氮，送回生物样本库并将其入库。在患者肠道情况允许的情况下，术者在患者左半结肠钳取 2 块黏膜样本，若患者肠道内存在息肉，钳取 2块息肉样本。

1.5.2.2 血液样本 主管大夫下达医嘱，病房护士负责执行，抽取捐献者血样。分别抽取2 ~ 3 ml 至黄管和深紫管，并将血液样本取材单填写完整。由院内配送人员将血液样本送至生物样本库。样本库工作人员在接收到样本后负责样本的编号、处理、信息录入、样本入库等一系列工作。样本处理步骤如下：将患者信息录入系统，创建血清样本 4 管，血浆样本 4 管，血细胞 2 管，入库至相应位置并打印出条码；血液样本 3500 r/min 离心 10 min；将血清、血浆吸出各分装在 4 个 1.5 ml 的 EP 管中；抗凝血血浆吸出后将中间白层 0.5 ml 置于 1.5 ml 的 EP 管中，取 2 管；加入1 ml RBC 裂解液，混匀，以3500 r/min离心10 min，（必要时则重复一次）；弃上清，加入 1 ml 三蒸水洗沉淀一次 3500 r/min 离心10 min；弃上清，将打印出的标签依次贴在相应的样本上；按照标签上的样本位置将样本放入对应的冰箱中。

1.5.2.3 粪便样本 留取患者的粪便样本也是为了检测患者的肠道菌群。因抗生素、益生菌及饮食对肠道菌群有影响，需按要求严格控制药物及饮食。门诊患者采取粪便收集盒收取粪便样本，并由患者本人送至生物样本库。门诊大夫负责告知患者，并发放 NAFLD 患者粪便收集告知单（图 1）。病房患者粪便样本收集完成后由院内配送人员送至生物样本库。门诊及入院患者的粪便样本送至样本库后，由样本库工作人员统一入库并贴签放入–80 ℃超低温冰箱。

1.5.3 样本的质量控制 为保证样本质量符合后期研究的需要，样本库工作人员应定期对收集到的样本进行质控。每月月底对收集到的样本进行盘库，防止样本位置错放、样本标签漏贴、错贴。盘库时采取随机抽样的方式，两人合作，盘库速度要快，严格杜绝样本反复冻融。盘库结束后修正纰漏，做出当月盘库报表、分析数据，若错误率超过 3%，全部盘库。

每半年随机抽检样本进行样本质检。随机抽取 8 例患者的样本进行质控，血细胞提取 DNA，测浓度及260/280。肠黏膜样本研磨后用 Trizol 法提取 RNA，并进行 RNA 电泳分析样本 RNA 的稳定性。

1.6 样本的出库及使用

样本使用前，申请使用者需向生物样本库提交样本使用申请单，样本使用申请单要写明所需样本的课题名称、使用者姓名及联系方式以及样本具体的后续实验。样本使用申请单经申请者科室主任签字后交由生物样本库，经样本库组委会审批完成，样本方可出库。申请者完成实验后需将实验结果反馈给生物样本库，样本库管理员将实验结果录入样本库质检系统中。

2 结果

北京大学人民医院生物样本库自 2013 年 5 月至今收集 108 例 NAFLD 患者的肠黏膜、血液、粪便样本，共1046 管。建库以来，根据入组条件和入组要求，尽可能全面将非酒精性脂肪性肝病患者的样本按照 NAFLD 样本控制体系的要求纳入样本库中。

非酒精性脂肪肝患者粪便收集告知单 因您参与本课题，并已签署相应的知情同意书。您已于 年 月 日在 XX 科就诊，我们希望您在就诊后的两周不服用抗生素和益生菌；不食用辣椒、酸奶，并配以清淡饮食（不食用肥肉、鸡肉等），每日以青菜、主食为主，配以少量精瘦肉。粪便标本采集时应挑取有脓血、黏液部分；外观无明显异常时，应于粪便内外多点取样；液状粪便取絮状物 2 ~ 5 ml，盛于粪便收集管或无菌容器中。并在 -- 年 -- 月 -- 日使用我们发给您的粪便收集盒，收集 5 g 左右粪便（粪便收集盒一匙），在收集盒上标上您的名字。如您是门诊患者请在 1 ~ 2 天内送到 ------。如您是入院患者，样本取材完成后请将样本交由病房护士。衷心感谢您的配合！

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随机抽样 8 例患者的 16 管黏膜样本、16 管血液样本检测 RNA 完整性及 DNA 纯度均符合后续研究需求。血细胞提取 DNA 后用紫外分光光度计测260/280均处于 1.8 ~ 2.0 之间，表明样本质量较好。将黏膜样本研磨后用 Trizol 法提取样本总 RNA，260/280均在 1.8 ~ 2.0 之间，表明 RNA 纯度较好。非变性 RNA 电泳的结果如图 2 所示，可见明显的 28S 和 18S，其中 2 号和 16 号样本的 RNA 28S 条带消失，样本存在一定程度的降解，因此可以得出我们抽检的 16 管肠黏膜样本的 RNA 完整性的合格率是 87.5%，可以满足后期的研究需求。

3 讨论

近年来针对 NAFLD 的研究热度逐渐升高，患者的样本是进行科学研究最宝贵的资源，样本的收集、运输以及保存直接关系到样本的质量和后期研究的成败。随着“十二五”科技计划的推进，我国生物样本库的建设正处于蓬勃发展中，样本的留取和保存也越来越规范。北京大学人民医院生物样本库在建库过程中严格按照规范进行，NAFLD 样本取材、处理、入库、质控及出库等各个环节中，严格遵守院内建立的质量控制体系。

为尽量避免个体差异，在患者入组前，我们设定了患者入组标准，对入组的每一个患者进行严格的把控。NAFLD 患者一经确认入组，主管大夫会和患者签定知情同意书。生物样本库工作人员专门负责后期的样本收集、处理、入库、质检等相关性工作。

血液样本由门诊或者病房护士抽取，然后由专职人员送至生物样本库，样本库工作人员在 2 h 之内分离血清、血浆、血细胞，贴上对应的条码放入–80 ℃超低温冰箱中。NAFLD 患者的肠黏膜样本尤为珍贵，一旦患者做肠镜检查，术者会提前电话通知生物样本库取材人员，取材人员备液氮罐、冻存管到内镜室进行取材。在肠黏膜样本的运输及冻存方法上我们进行了多次试验，步骤如下：①取材后常温运输到样本库，入库贴签后–80 ℃超低温冰箱保存；②取材后液氮运输罐运输到样本库，入库贴签后–80 ℃超低温冰箱保存；③取材后液氮运输罐运输到样本库，入库贴签后液氮箱保存。我们对以上三种方法收集和保存的肠黏膜样本分别进行了 Trizol 法提取 RNA，并进行 RNA 琼脂糖凝胶电泳。通过试验我们发现前两种方法收集和保存的肠黏膜样本 RNA 降解特别严重，RNA 电泳跑出的条带弥散，无 28S 和 18S 条带。所以为保证肠黏膜的质量，我们将取到的肠黏膜放入 2 ml 无 RNA 酶冻存管后旋紧即刻放入液氮运输罐中，待样本运输到样本库后立即进行样本入库和贴签，然后放入液氮箱长期保存，贴标签动作要快，严格杜绝肠黏膜样本的冻融。粪便样本在收集过程中为保证粪便的活性，要使用 SARSTEDT 粪便采集管来收集。由样本库工作人员负责发放采便管，患者在按照粪便留取告知单中的注意事项饮食之后留取粪便并在 3 d 内送至生物样本库。样本库工作人员收到粪便样本后将样本分装在 4 个冻存管中，贴标签后入库到相应的–80 ℃超低温冰箱中。

通过严格遵守样本质量控制体系规定的样本取材、处理、入库流程，样本库收集到的 NAFLD 样本均符合后期研究的需求。所以说严格的样本质控对样本质量起到至关重要的作用。

[1] Dong S, Liu P, Sun MY. The development of treatment for NAFLD. Liaoning J Traditional Chin Med, 2013, 40(3):599-602. (in Chinese)

董姝, 刘平, 孙明瑜. 非酒精性脂肪肝的治疗研究进展. 辽宁中医杂志, 2013, 40(3):599-602.

[2] Luthra A, Nigam P, Misra A. Metabolic correlation and management strategies of non-alcoholic fatty liver disease: an Asian Indian perspective. Diabetes Metab Syndr Clin Res Reviews, 2007, 1(4):279- 285.

[3] Farrell GC, Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis. Hepatology, 2006, 43(2 Suppl 1):S99-S112.

[4] Zhang YJ, Gao FF, Peng WK, et al. The experience to set up a quality contrd system for bio bank. Translational Med J, 2014, 3(3):170-173, 188. (in Chinese)

张育军, 高芳芳, 彭卫康, 等. 生物样本库质量控制体系建立的经验和体会. 转化医学杂志, 2014, 3(3):170-173, 188.

[5] Zhang YJ, Ye L, Gao FF, et al. Construction of biological sample library is the cornerstone for clinical medical research. Translational Med J, 2014, 3(6):347-351, 355. (in Chinese)

张育军, 叶磊, 高芳芳, 等. 生物样本库建设是临床医学研究的基石. 转化医学杂志, 2014, 3(6):347-351, 355.

[6] Duan LJ, Zhang J, Zhou XG. A pilot study for the standard operating procedure on tumor tissue bank. Med Philos (Clin Decis Making Forum Ed), 2010, 31(10):28-30. (in Chinese)

段刘剑, 张杰, 周晓光. 肿瘤组织库规范化操作程序的探讨. 医学与哲学(临床决策论坛版), 2010, 31(10):28-30.

[7] Zhang JX, Yang Y, Wu YF. Application of standardization of dual bar code on clinical tissue bank management. Chin Hosp Manag, 2011, 31(3):64-65. (in Chinese)

张俊星, 杨远, 吴益飞, 等. 双重条形码技术在临床组织样本库标准化管理中的应用. 中国医院管理, 2011, 31(3):64-65.

[8] Campbell LD, Betsou F, Garcia DL, et al. Development of the ISBER best practices for repositories: collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank,2012, 10(2):232-233.

[9] Chen LZ, Zhang HY, Jiang M, et al. Establishment and management of nonalcoholic fatty liver disease biobank. J Clin Hepatol, 2014, 30(9):906-909. (in Chinese)

陈立震, 张海英, 姜曼, 等. 非酒精性脂肪性肝病生物样本库的建立与管理. 临床肝胆病杂志, 2014, 30(9):906-909.

[10] Wang XW, Gao PF, Yao GQ, et al. Research progress on relationship between NAFLD and gut microbiota/probiotics. Mode Prev Med, 2015, 42(12):2153-2155, 2174. (in Chinese)

王晓伟, 高鹏飞, 姚国强, 等. 非酒精性脂肪肝与肠道菌群及益生菌的相关性研究进展. 现代预防医学, 2015, 42(12):2153-2155, 2174.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.018

张育军，Email：rmzxzyj@163.com

2017-06-29