PD-1/PD-L1/PD-L2小分子抑制剂的研究进展

谢永丽，丁寄葳，岑山，周金明



PD-1/PD-L1/PD-L2小分子抑制剂的研究进展

谢永丽，丁寄葳，岑山，周金明

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所免疫室

据世界卫生组织相关数据显示，全球每年大约有 880 万人死于恶性肿瘤，且增长态势显著，对人类健康造成了严重的威胁。研究显示免疫系统在人体自身稳态的维持中起着关键性作用，特别是近十年来随着较多肿瘤免疫药物被 FDA 批准上市，该疗法已成为肿瘤治疗领域的焦点。因此，2013 年《科学》将其选为当年“最重要的突破”[1]，2015 年又将肿瘤免疫联合治疗列为“最值得关注的四项科学进展”之一。在肿瘤免疫治疗突破性进展中，免疫检查点抑制剂的发展最成熟，特别是靶向程序性死亡因子 1 与其配体（PD-1/PD-L1/PD-L2）检查点蛋白的抑制剂，疗效佳且治疗肿瘤类型多。因此，本文总结了近些年在肿瘤的免疫治疗领域中有关 PD-1/PD-L1/PD-L2 检查点蛋白抑制剂的研究进展，特别是极具潜力的小分子抑制剂的发展，为众多关注该领域的研究者提供依据。

1 免疫检查点蛋白 PD-1 及其配体 PD-L1/PD-L2 在肿瘤免疫治疗中的研究

肿瘤免疫疗法通过调节、激活免疫系统来治疗肿瘤，重点在被动免疫治疗，即通过外源输入机体免疫效应物质以调动机体免疫系统来治疗疾病[2]，典型的如CAR-T 疗法及各检查点蛋白信号通路抑制剂疗法。而从现有临床药物的使用上看，检查点蛋白抑制剂已占据较大市场份额，预计 2023 年将会突破 130 亿美元的销量，成为肿瘤免疫治疗中的“明星”药物[3]。免疫检查点分子大都属于 B7/CD28 及 TNF/TNFR 超家族成员，是免疫共刺激或共抑制分子[4]，通过实时协同调节淋巴细胞的活性进而影响机体的免疫应答。在机体的免疫调控中，各检查点分子发挥复杂的免疫调节作用，这些分子种类繁多，常见的如PD-1、CTLA-4、IDO、TIM3 等[4]。PD-1 与 CTLA-4 这两个检查点蛋白，特别是前者，在目前临床研究中关注最多，且已在临床取得成功应用，极大地推动着肿瘤免疫治疗的进展。

1.1 免疫检查点蛋白 PD-1 及其配体 PD-L1/PD-L2 的结构和功能

PD-1，也称为 CD279，属于 B7-CD28 受体家族成员[5-6]。PD-1 是一个55 kD 的 I 型表面跨膜糖蛋白受体，由 288 个氨基酸组成[7]（图 1）。该蛋白包含 4 个结构域，胞外区为一个 lgV 样的免疫球蛋白超家族结构域，胞质区为一由 95 个残基组成的结构域，还有一由 22 个残基组成的柄和一跨膜结构域。其中胞质结构域中包含两种酪氨酸依赖性的免疫受体信号基序，即免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motify，ITIM）与免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motify，ITSM）。与 B7-CD28 其他家族成员不同，PD-1 通常以单体而非同源二聚体形式存在。

PD-1 的两个配体PD-L1 与 PD-L2，也分别称为 CD274 与 CD273，两者先后是由 290 与 270 个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，两者都属于 B7 配体家族，有 34% 的同源性。此外两者有着类似该家族其他成员的共同结构基础，即其胞外结构域包括两个并排的结构域，1 个 IgV 样区和 1 个 IgC 样区，其可直接与 PD-1 结合。PD-L1 或 PD-L2 与 PD-1 结合，受抗原受体信号转导使得 PD-1 胞质区两个酪氨酸信号基序磷酸化，从而激活下游信号途径，最终破坏 T 细胞的糖代谢及 IL-2 等信号因子的产生，使得 T 细胞丧失免疫功能[8]。此外，PD-L1/PD-L2 共有一段大概由 30 个残基组成的保守胞内结构域，其功能至今未知[9]。

图 1 PD-1的基因及其编码的蛋白质的结构域

与其他 B7-CD28 受体家族成员相比，PD-1 的表达受 T 细胞活性的调控，此外 PD-1 也在 B 细胞、NK 细胞、NKT 细胞以及 DC 细胞中表达[10]。其配体 PD-L1 与 PD-L2 的表达有着很大区别，PD-L1 在 T 细胞、B 细胞、DC 细胞、巨噬细胞以及非造血细胞等多种细胞中均有表达，而 PD-L2 仅在 B 细胞集中表达，通过细胞因子依赖的方式诱导也可在 DC 细胞、单核细胞、巨噬细胞中部分生成[10]。也正因为 PD-L2 的表达相对 PD-L1 表达所涉及的范围小，其对 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的调节作用远不及 PD-L1，因此目前针对 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的研究主要集中在 PD-1/PD-L1 相互作用上。

外周组织活化的 T 细胞表达的 PD-1，通过与配体 PD-L1、PD-L2 结合，来抑制 T 细胞的迁移、增殖和炎症因子的分泌[11-12]。在正常状态下，机体凭借 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的负性免疫调节作用防止免疫系统的过度激活以及保持系统对自身抗原的免疫耐受。但是该信号通路中的检查点蛋白过表达，就会产生针对 T 细胞受体（TCR）或者 B 细胞受体（BCR）交联的共抑制信号及促进免疫系统的病理性耐受。在肿瘤微环境中过表达 PD-L1/PD-L2，均会导致免疫抑制效应的产生[13]，从而使得该条件下的肿瘤细胞逃避免疫系统的监视，因此能够快速增殖、转移[10]。

1.2 PD-1/PD-L1/PD-L2信号通路抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应用

目前成功用于临床治疗的阻断 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的药物主要为抗体药物，如美国 FDA 在 2014 年 12 月和 9 月分别批准上市的应用于晚期黑色素瘤的纳武单抗（nivolumab）[14]和派姆单抗（pembrolizumab）[15]，均是靶向 PD-1 的人源化单克隆抗体。同时，由于检查点蛋白抑制剂本身并不针对特定的肿瘤细胞，而是针对肿瘤微环境中的 T 淋巴细胞，这使得 PD-1/PD-L1/PD-L2 检查点抑制剂的研究向着除黑色素瘤之外的其他实体瘤方向开展[16-18]。如 PD-1 阻断剂纳武单抗与派姆单抗在 2015 年 3 月，被美国 FDA 批准用于晚期或者转移性非小细胞肺癌的治疗。另外，在 2016 年，美国 FDA 又批准上市了用于治疗特定类型膀胱癌的靶向 PD-L1 的阿特朱单抗（atezolizumab），另一 PD-L1 抑制剂 durvalumab（MEDI-4736）由 FDA 批准用于治疗 PD-L1 阳性转移性尿路上皮膀胱癌。目前罗氏制药又尝试将阿特朱单抗和 durvalumab 用于非小细胞肺癌的治疗，且已处于临床研究阶段[19]。此外，用于膀胱转移性细胞癌或非小细胞肺癌的MPDL3280A 与用于治疗非鳞非小细胞肺癌的 BMS-936558，以及其他单克隆抗体如 AMP-514 与 pidilizumab[20]等均进入了临床研究阶段。

同时，靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号途径的组合型免疫治疗药物的研发，在近几年受到更多研发人员的青睐。已经处于 II 期临床的 CheckMate-069，就是纳武单抗与易普利（ipilimumab）单克隆抗体的联合体，研究结果显示，相比于两单抗的单独用药，CheckMate-069 对黑色素瘤有着更好的疗效[21]。除了将 PD-1/PD-L1/PD-L2 抑制剂与其他检查点抑制剂联合使用之外，将其与肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptors，TNFRs）、过继性 T 细胞治疗、肿瘤疫苗以及其他靶向药物的联合使用也受到越来越多研究者的重视[22]。如已经有 PD-1 抑制剂与血管内皮细胞生长因子受体（vascular endothelial growth factor，VEGFR）抑制剂联用的专利出现[23-25]。

2 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路小分子抑制剂的发展现状

虽然靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的单克隆抗体受到高度重视且突破性成果不断出现，但因其研发成本昂贵、运输和贮存条件要求苛刻，加上抗体药物自身稳定性差以及不能口服使得制剂类型受限，此外临床跟踪数据显示部分患者对于该类药物的治疗并不敏感[26]，从而使得最近几年来，不少研究者将靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2信号通路的抑制剂向着传统小分子药物领域拓展，检查点蛋白小分子抑制剂受到越来越多的关注。目前已经有针对 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的小分子抑制剂处于 I 期临床，如下文将会讨论的 CA-170。

靶向 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的小分子抑制剂的发展落后于单克隆抗体，主要是因为在过去较长的一段时间中，人们对 PD-1 与 PD-L1/PD-L2 蛋白之间相互结合信息的了解较为滞后。但 2008 年 Lázár-Molnár等[27]和 Freeman[28]先后将鼠源 PD-1 与人源 PD-L1 蛋白结合模式信息揭示后，就已经有部分企业进行了靶向 PD-1/PD-L1 小分子药物的设计开发，如美国施贵宝公司于 2015 年报道的靶向该免疫检查点蛋白的系列小分子抑制剂（图 2，化合物 1）。该类小分子抑制剂旨在通过阻断 PD-1 与 PD-L1 的结合，来克服 PD-1/PD-L1 通路的活化所导致的免疫拮抗性疾病，如肿瘤和 HCV 等[29]。均相时间分辨荧光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）实验显示，基于该化合物骨架的 9 个化合物均表现出较好的活性，其中以化合物 2 为代表的 A 类化合物的 IC50值可达纳摩尔水平[30]。

之后，Zak 等[31]以 BMS202、BMS-8 为模式化合物，阐明了这类小分子抑制剂的作用原理。该研究指出这类小分子抑制剂通过作用于 PD-L1 蛋白表面，引起 PD-L1 形成二聚体，而 BMS202、BMS-8 小分子化合物分别结合于两个二聚化的 PD-L1 的圆柱形疏水腔中。二聚化后的 PD-L1/PD-L1 蛋白-蛋白相互作用表面与 PD-1/PD-L1 蛋白-蛋白相互作用表面具有高度重合性，导致 PD-1 与 PD-L1 无法产生正常的相互作用从而阻断该信号通路。

化合物 1 化合物 2化合物 3 化合物 4化合物 5 化合物 6化合物 7 化合物 8化合物 9

值得关注的是，目前已经有抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的小分子化合物处于临床研究阶段，CA-170 就是其中最重要的代表。研究者从 B7 免疫球蛋白超家族成员检查点蛋白相互作用面的模拟物库中出发，筛选得到 CA-170，其作为一种针对 PD-L1、PD-L2 与 VISTA/PD-1H 检查蛋白信号途径的口服拮抗剂，目前已经进入了 I 期临床研究。体外研究发现，CA-170 对 PD-1/PD-L1/PD-L2 或 VISTA/PD-1H 信号通路均表现出跨种属拮抗效应，且口服给药能够呈剂量依赖性地促进肿瘤浸润与外周 T 细胞的活力，因而抑制小鼠体内同系肿瘤的生长。但 CA-170 化合物的结构至今未见报道。

2015 年，Sasikumar 等[32]申请了能够抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的小分子化合物 1,2,4-二唑和 1,2,4-噻重氮的衍生物的专利（图 2，化合物 3）。研究发现，这类小分子药物能够在骨癌、头颈癌、胰腺癌等多种癌症，以及细菌、病毒感染性疾病中有效地抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2信号通路，从而逆转免疫系统的抑制状态。Sasikumar 也是 CA-170 的专利申请人之一。此外，Harvard 等[33]构建了转基因组成性表达 PD-L1（PD-1c）与PD-L1 基因敲除（PD-1−/−）的小鼠模型，将合成的以磺胺甲氧嗪与磺胺甲二唑（图 2，化合物4、5）为代表的化合物，在体外利用 PD-1cT 细胞和 PD-1−/−T 细胞进行效能测试。结果发现此类化合物在 0 ~ 10 mmol/L 的浓度范围内都有抑制活性，两者被期待用于纠正机体免疫紊乱所致疾病。

国内目前对于 PD-1/PD-L1/PD-L2 检查点信号通路小分子抑制剂的研究也逐渐受重视。2016 年 3 月吉林大学研究者发现，氨基或者二甲基氨基甲酸酯取代的间苯二酚有着抑制 PD-1/PD-L1 信号通路的潜力[34]。他们在Lin 等[35]和 Zak 等[36]报道的 PD-1/PD-L1 复合物结构及 Harvard 等[33]对磺胺甲二唑与磺胺甲氧嗪研究结果的基础上，以能够保证V 型结构域完整的间苯二酚和巯基取代的间苯二酚为原料合成了 13 个化合物。之后进行活性筛选得到氨基或者二甲基氨基甲酸酯取代的间苯二酚能够与 PD-1 结合，从而阻断 PD-1 与 PD-L1 的结合来发挥功效，其中活性最高的结构如图2 化合物 6。

图 3 人源单体 PD-1 的结构（A）和人源 PD-1（红色条带）与人源 PD-L1（蓝色条带）聚合体的结构（B）（与单体 PD-1 相比，聚合体 PD-1 发生变构，其中 CC' 环发生了明显的重排。黄色条带表示 62-82 位氨基酸残基，绿色条带表示 CC' 环 70-77 位氨基酸残基）

另外，分子量介于单克隆抗体和传统小分子化合物之间的小分子肽类药物也是近些年的关注热点之一。Aurigene Discovery Technologies 与 Pierre Fabre 宣布计划发展 AUNP-12（图 2，化合物 7），来抑制 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号途径以治疗癌症[33, 37-38]{SASIKUMAR, 2013 #40}，该小分子肽目前处于临床前研究阶段[30]。研究表明，AUNP-12 有着较强的抗肿瘤活性，体外实验显示其抑制 PD-1 与 PD-L2 结合的 EC50可达 0.72 nmol/L，但是药代时间较短。因此在该基础上，研究者进行了进一步的改造，得到了专利 WO 2013/144704（图 2，化合物 8）、WO 2012/168944（图 2，化合物 9）报道的化合物，两者均表现出纳摩尔级别的 EC50[30]。

3 PD-1/PD-L1/PD-L2 小分子抑制剂的展望

目前虽然还没有上市的 PD-1/PD-L1/PD-L2 小分子抑制剂，但是国内外对于PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路小分子抑制剂的研究越发重视。PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路小分子抑制剂的发展相对落后于单克隆抗体，主要是由于 PD-1/PD-L1/PD-L2 相互作用信息缺乏。2015 年 10 月，Zak 等[31]初次报道了人类 PD-1 与 PD-L1 蛋白结合复合物的结构信息，即 PD-1 与 PD-L1 蛋白按 1:1 结合形成复合物，两者之间的相互作用类似于 T 细胞受体与抗体lg V 型区域的结合，即由蛋白-蛋白相互作用区域正面的 GFCC'β 折叠片来介导结合[36]。PD-1 在与 PD-L1 结合时，其 Met70-Asp77 处的 CC' 环将会从远离结合位点的“开放”状态发生 90° 扭转从而转换成“封闭”状态，这一变化就使得 PD-1 与 PD-L1 二聚体之间形成了 4 对氢键（PD-1 的 Gln75 与 PD-L1 的 Asp26、Arg125 形成 3 对氢键、PD-1 的 Thr76 与 PD-L1 的 Tyr123 形成 1 对）（图 3）。该研究结果为阻断 PD-1/PD-L1 结合小分子抑制剂的研发提供了结构生物学基础。Zak 等[36]还指出人类 PD-L1 蛋白的表面有三个“热点”。其中 Ile134 与 Ile126 处形成的疏水口袋，能够分别与六元芳香环和脂肪烃支链结合，被认为是小分子药物作用的位点。但该研究也显示，在 PD-1 与 PD-L1 形成二聚体后，其交互界面之间同时存在疏水和极性作用，同时也因为 PD-1 空间构象的变换，其部分残基继续形成氢键，这就增加了针对该结合模式的抑制性小分子的设计难度。因此，发展靶向 PD-1/PD-L1 信号通路的小分子抑制剂可谓“机遇与挑战并存”。尽管目前还没有出现成功的针对 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号途径的临床小分子化学药物，但是随着对 PD-1 与其两个配体之间结合信息的了解的不断深入，加上理性药物设计的发展，定会有更多的活性化合物被不断发现。此外，小分子药物与单克隆抗体的联用也不断被尝试，我们也期待这一手段在将来会更加成熟，以提高现有药物的疗效。

4 总结

综上所述，PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的阻断剂在临床肿瘤免疫治疗中取得了令人欣喜的治疗效果。虽目前已经成功发展了针对部分癌症的单克隆抗体，但其研发成本高，不稳定且有潜在的免疫原性副作用，使得对多肽类和小分子抑制剂，特别是小分子抑制剂的研究受到了越来越多的关注。因为传统的小分子药物与抗体药物相比，有着研发成本较低、制剂多样、可口服、较好的肿瘤微环境渗透作用等诸多优势。同时，PD-1 与其配体 PD-L1/PD-L2 之间相互作用信息以及形成的二聚体表面结合热点的解读也越来越深入，这更是为抑制该信号通路的小分子药物的理性设计提供了重要的结构依据。目前，已经有进入 I 期临床的 PD-1/PD-L1/PD-L2 信号通路的小分子抑制剂，如前面提到的 CA-170，更多具有潜在生物活性的化合物处于临床前研究阶段。此外，就肿瘤免疫治疗措施本身而言，其所调动的免疫系统中，肿瘤相关性可调控因子与通路众多，这也为小分子化合物提供了丰富的作用靶标。因此，在有望能够治愈癌症的免疫疗法中，检查点蛋白小分子化合物免疫制剂在肿瘤中的应用范围定会进一步拓展，包括小分子免疫制剂治疗癌症的类型和针对的药理靶点，从而为肿瘤患者带来更加光明的治疗前景。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.009

国家自然科学基金（81672559、81311120299）

周金明，Email：zhoujinming@imb.pumc.edu.cn；岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

2017-06-05