Caspase-3、Survivin在UVB诱导HaCaT凋亡细胞中的表达

惠海英，吴娜，宫艳艳，肖生祥

（1.陕西省人民医院，西安710068；2.西安交通大学第二附属医院，西安710004）

·论著·

Caspase-3、Survivin在UVB诱导HaCaT凋亡细胞中的表达

惠海英1，吴娜1，宫艳艳1，肖生祥2

（1.陕西省人民医院，西安710068；2.西安交通大学第二附属医院，西安710004）

目的探讨Caspase-3、Survivin在UVB诱导HaCaT凋亡细胞中的作用。方法研究对象为人角质形成细胞HaCaT细胞，实验分为正常对照组、10、20、40、80 mJ/cm2中波紫外线组（UVB）。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法观察增殖能力；流式细胞仅（FCM）实验检测细胞凋亡；实时定量PCR、Western-blot检测细胞内的Survivin、Caspase-3表达水平。结果与正常对照组相比，NB-UVB照射组细胞增殖抑制作用及凋亡明显增强（P＜0.05），并随着照射剂量的增加，其细胞凋亡作用增加。同时与正常对照组相比，不同UVB照射剂量组Caspase-3表达均增强，其表达增强程度随着照射剂量的增加而增加，与正常对照组相比，10 mJ/cm2照射组，细胞表达Survivin水平最高（P＜0.05），20 mJ/cm2组Survivin表达水平下降，稍低于对照组水平，40、80 mJ/cm2组Survivin进一步下降，较对照组下降明显（P＜0.05）。结论Survivin、Caspase-3参与了UVB诱导HaCaT凋亡细胞。Survivin表达水平与UVB辐射剂量有关。

HaCaT细胞；凋亡；中波紫外线；生存素；死亡蛋白酶-3

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1 材料

1.1.1.1 细胞人永生化HaCaT细胞株为第四军医大学西京医院皮肤科李承新教授馈赠。

1.1.1.2 试剂DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司)，噻唑兰（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（美国sigma公司）。Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）。Survivin、Caspase-3兔多克隆抗体（美国SANTA公司）。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（日本Takara公司）。PCR引物由上海华大生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.2 仪器电泳仪（美国Bio-RAD公司）、酶标仪（美国Bio-Tek公司）、电转槽（美国Bio-RAD公司）、流式细胞仪（美国BD-FACScalibur）、FluorChem FC2凝胶成像分析系统（美国Alpha Innotech公司）、7500型实时定量PCR检测仪（美国ABI公司）。SS-03B型光疗仪（上海Sigma公司，波长311 nm）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组本实验研究共分为5组（正常对照组，10 mJ/cm2、20 mJ/cm2、40 mJ/cm2和80 mJ/cm24个剂量组）。

1.2.2 细胞株培养HaCaT细胞株常规方法复苏后，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM的低糖培养基，置5%CO2培养箱（37℃，相对湿度95%）培养，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞制成4×104单细胞悬液，接种于6孔板后继续培养24 h给药。

1.2.3 UVB照射待细胞生长至每孔融合80%～90%时，吸去培养基，加入2 mL磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS），细胞暴露于UVB灯管下，照射距离约为10 cm，给予不同的辐射剂量（10、20、40、80 mJ/cm2）照射。紫外线照射后，吸去PBS，并在各孔中重新加入培养液继续常规培养。

1.2.4 MTT法检测HaCaT细胞增殖率取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞数为4.0×104/mL，以每孔100 μL接种于96孔培养板，培养24 h后去原培养液进行实验。实验组及正常对照组各100 μL，每个浓度设3个复孔，于37℃、5%CO2条件下培养。培养结束前4 h，每孔加入MTT（5 ng/mL）20 μL。培养结束时，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪分别测定培养24、48、72 h吸光度（A570值），细胞增殖率＝（实验组平均A值/空白对照组平均A值）×100%。

1.2.5 流式细胞仪Annexin V-FITC/PI检测HaCaT细胞早期及中晚期总凋亡率HaCaT细胞经不同照射剂量的UVB照射后24 h，经0.25%胰酶细胞消化液（Trypsin-EDTA）消化，1 500转/min离心6 min，培养液弃去，PBS洗3次，收集的细胞经70%的乙醇4℃固定2 h，14 000转/min离心2 min，固定液弃去，PBS缓冲液（含5 mmol/L EDTA）500 μL进行细胞重悬，以1×binding buffer制成单细胞悬液，置于流式管，每组设6个样，加Annexin V-FITC 10 μL与PI 5 μL，混匀后室温下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合后于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.2.6 实时定量PCR检测HaCaT细胞Caspase-3、Survivin mRNA表达上一步孵育的细胞吸去培养液，经0.25%胰蛋白酶液分别制成细胞悬液，分别装入离心管，1 500转/min离心，收集细胞，利用TaKaRa细胞总RNA抽提试剂盒提取各组细胞总RNA，采用TaKaRa反转录试剂盒按照说明书以RNA为模板反转录为CDNA，采用荧光定量PCR试剂盒按照说明书以CDNA为模板进行PCR反应，然后使用ABI 7500 PCR仪进行荧光PCR。引物由上海华大生物公司合成，序列见表1。实时定量PCR反应条件：94℃预变性3 min，扩增40个循环，每循环中，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，采集荧光信号；40循环结束后，经94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，采集熔解曲线。使用7500型Real-time PCR仪分析软件进行数据分析。以β-actin为内参基因，计算同一样本中目的基因与内参基因的含量比值，评价目的基因的表达水平。每个样本取3个复孔，PCR重复3次。

表1 引物序列及产物大小

1.2.7 Western-blot检测HaCaT细胞Caspase-3、Survivin蛋白表达HaCaT细胞经不同照射剂量的UVB照射后48 h，以含0.1%DMSO的培养基为阴性对照组。Western blot检测Caspase-3、Survivin蛋白表达水平，β肌动蛋白作为内参蛋白，按照如下步骤进行操作：进行处理后细胞收集，4℃预冷PBS液洗3次，加入细胞匀浆液（50 mmol/L This-HCl pH=7.4，1%Triton X-100，0.2 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF，1 mmol/L EDTA），4℃、12 000转/min条件下离心10 min，吸取上清，收集蛋白，收集细胞后用2×上样缓冲液处理，检测总蛋白浓度，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，上样量（30 μg），湿转硝酸纤维素膜（NC），用50 g/L脱脂牛奶室温封闭30 min，不同浓度稀释一抗Caspase-3（1∶1 000）、Survivin（1∶500）、β-actin（1∶1 000）孵育，4℃过夜，辣根过氧化酶（HRP）标记抗鼠/兔IgG二抗常温孵育1 h，缓冲液TBST洗膜，化学发光试剂显色、扫描并进行吸光度分析、计算蛋白相对表达水平。

1.2.8 统计学方法采用统计软件SPSS19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UVB照射对HaCaT细胞增殖活性的影响与对照组相比，各UVB照射组照射可使细胞24 h后的增殖率均下降，随着照射剂量的增加，其细胞增殖活性逐渐降低（*P<0.05），见图1。

图1 不同处理组的细胞生长增殖率

2.2 UVB照射对HaCaT凋亡细胞率的影响细胞处理24 h后，进行流式细胞术检测，发现与正常对照组相比，各UVB照射组照射可使细胞凋亡增加，随着照射剂量的增加，其细胞凋亡率也增加（*P<0.05），见图2。

图2 不同处理组细胞凋亡率

2.3 UVB照射对HaCaT细胞Caspase-3、Survivin mRNA表达的影响细胞处理24 h后进行检测，与正常对照组相比，不同UVB照射剂量组Caspase-3 mRNA表达均增强，其表达增强程度随着照射剂量的增加而增加，40、80 mJ/cm2照射组Caspase-3 mRNA明显增加（*P<0.05）；与正常对照组相比，10 mJ/cm2照射组，细胞表达Survivin水平最高（＃P<0.05），20 mJ/cm2组Survivin下降，稍低于对照组水平（＃P>0.05），40、80 mJ/cm2组Survivin进一步下降，较对照组下降明显（＃P<0.05），见图3。

图3 不同处理组Caspase-3、Survivin mRNA表达

2.4 UVB照射对HaCaT细胞Caspase-3、Survivin蛋白表达的影响细胞处理48 h后进行检测，与正常对照组相比，不同UVB照射剂量组Caspase-3蛋白表达均增强；而Survivin蛋白的表达以10 mJ/cm2照射组为最高（P<0.05），其后随着照射剂量的增加，Survivin蛋白逐渐下降，见图4。

图4 Caspase-3、Survivin蛋白表达

3 讨论

自然光中的紫外线辐射是诱发人类皮肤癌的重要环境因素。在美国每年大约有100万人被确诊为皮肤癌，皮肤癌也是美国最常见的癌症类型之一[3]。动物模型实验证明了UV辐射不仅是肿瘤诱发剂而且还是肿瘤促进剂，关于紫外线诱导肿瘤的确切机制仍不清楚，大量研究表明中波紫外线对角质形成细胞的DNA损伤，是诱发皮肤肿瘤的基础。由于细胞凋亡与皮肤肿瘤发生的相关性，长期或大量UVB辐射可诱导凋亡相关蛋白的表达。近年来紫外线诱导细胞凋亡尤其是角质形成细胞凋亡引起了人们的关注[4]。

Caspase是执行凋亡的主要酶类，被称为死亡蛋白酶,是细胞凋亡的中枢效应器，细胞凋亡后期的共同途径由Caspase激活[5]。Caspase蛋白酶家族在细胞凋亡中的一个重要作用是使保护细胞远离凋亡的各种蛋白失活。Caspase-3处于Caspase蛋白酶系的核心地位，在Caspase酶系级联反应中发挥重要作用。Caspase-3可能是整个凋亡级联反应的中心环节之一，在几乎所有的凋亡中被最后活化的Caspase分子，被认为是凋亡的最终效应蛋白。UVB辐射后产生的ROS可促进细胞凋亡，增加细胞内钙离子（Ca2＋），降低线粒体膜电位，激活半胱氨酸蛋白酶（Caspase）蛋白[6]，最终引起细胞凋亡。

Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白（IAP）家族中新的一员，于1997年被Ambrosinin在人类基因组库的杂交筛选分离出来，是到目前为止所发现的最强的凋亡抑制因子[7]。Survivin具有调控细胞周期和细胞凋亡的双重功能。Survivin广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织,也表达于少数正常成人组织,包括人的皮肤组织。在人类皮肤KSCs及黑素细胞、成纤维细胞均有表达。在维持人类角质形成细胞细胞周期变化及细胞增殖中起很重要的作用[8]。Survivin通过抑制其Caspase-3、Caspase-7活性而抑制细胞凋亡[9]。

笔者以人角质形成细胞HaCaT细胞作为研究对象，研究了UVB诱导HaCaT细胞增殖抑制作用及凋亡抑制蛋白Survivin和凋亡蛋白Caspase-3的表达情况。与正常对照组相比，NB-UVB照射组细胞增殖抑制作用及凋亡明显增强，并随着照射剂量的增加，其细胞抑制作用及凋亡增强。同时与正常对照组相比，不同NB-UVB照射剂量组Caspase-3表达均增强，其表达增强程度随着照射剂量的增加而增加，与正常对照组相比，10 mJ/cm2UVB照射组，细胞表达Survivin水平最高，20 mJ/cm2组Survivin下降，40、80 mJ/cm2组Survivin进一步大幅度下降，较对照组下降明显。Survivin的表达水平先升后降，推测与其双重作用即调节细胞周期，稳定细胞生长，同时又抑制细胞凋亡有关。低剂量的UVB照射后，Survivin主要发挥调节细胞周期的作用，而高剂量的UVB照射后，Survivin主要发挥抑制细胞凋亡作用。以上结果表明Survivin、Caspase-3参与了UVB诱导HaCaT凋亡细胞。同时Survivin表达水平与UVB辐射剂量有关。

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Role of Caspase-3 and Survivin in HaCaT Cells Apoptosis Induced by UVB Irradiation

Hui Haiying1,Wu Na1,Gong Yanyan2,Xiao Shengxiang3
1.Shaanxi Provincial People's Hospital,Xi'an 710068,China;2.The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China

ObjectiveIn order to evaluate the role of Caspase-3,Survivin in HaCaT cells apoptosis induced by NB-UVB irradiation.MethodsHaCaT cells were divided into five groups,blank control group,10,20,40,80 mJ/cm2UVB radiation groups.After the HaCaT cells were irradiated by UVB,the cell viability measured by MTT assay,and reverse transcription quantitative PCR,Western-blotting were used to detect the expression levels of antiapoptotic gene Surviving,proapoptotic gene caspease-3.ResultsCompared with the control group,the expression of Caspase-3 was significantly increased,but effect-dose relationship could not be seen.Meanwhile the expression of Survivin was markedly up regulated of 10 mJ/cm2UVB radiation group,from 10 mJ/cm2to 80 mJ/cm2UVB radiation group,the Survivin level gradually decreased.ConclusionCaspase-3 and Survivin play an important role in HaCaT cells apoptosis induced by NB-UVB irradiation.The expression level of Survivin is related to the dose of UVB radiation.

HaCaT;Apoptosis;Ultraviolet B;Survivin;Caspase-3

R392.11

A

1672－0709（2017）04-0294－04

近年来,紫外线对人体的损伤已引起人们的广泛关注，资料表明日光中的紫外线特别是中波紫外线（Ultraviolet B,UVB）与皮肤的光老化、光损伤和光致癌的发生密切相关，严重威胁着人类的身体健康[1-2]。大量研究表明UVB对角质形成细胞的DNA损伤，是诱发皮肤癌的基础。长期的紫外线辐射会引起皮肤角质形成细胞生物学特性改变，导致细胞形态、活性及内部各种大分子及DNA的损伤，从而引起皮肤表皮层结构和功能变化。但UVB诱导人皮肤角质形成细胞损伤的具体机制尚不明确，本研究通过UVB诱导HaCaT细胞损伤，建立UVB损伤皮肤细胞模型，选取凋亡蛋白Caspase－3及凋亡抑制蛋白Survivin，通过观察HaCaT细胞增殖活性及凋亡情况，检测凋亡抑制蛋白Survivin和凋亡蛋白Caspase-3的表达水平，以期深入研究UVB辐射损伤的机制。

陕西省中医药管理局（2015lc039）；陕西省社会发展科技攻关项目（2016sf-156）

惠海英，E-mail：haiyinghui@163.com

2017-01-25）