实时定量聚合酶螺旋反应定量检测变形链球菌方法的建立

丁良，李芝香，汪慧渊，肖刚，郭青玉

西安交通大学 口腔医院儿童牙病科，陕西 西安 710004

实时定量聚合酶螺旋反应定量检测变形链球菌方法的建立

丁良，李芝香，汪慧渊，肖刚，郭青玉

西安交通大学 口腔医院儿童牙病科，陕西 西安 710004

目的：建立实时定量检测口腔内变形链球菌的实时定量聚合酶螺旋反应（PSR）方法。方法：针对变形链球菌的gtfB基因设计4套引物，通过实时浊度法和显色法两种方法判断结果。结果：从4套引物中筛选出最佳引物，并确定最佳温度为65℃；进一步实验表明采用最佳引物能特异性地检测变形链球菌，与13种其他病原核酸无交叉反应，敏感性达10拷贝/μL。结论：建立了实时定量检测变形链球菌的PSR方法，该方法具有简单快速、特异性强、敏感性高的特点，为实时定量检测变形链球菌提供了新技术。

聚合酶螺旋反应；变形链球菌；龋病；实时定量

变形链球菌（Streptococcus mutans）是口腔内的主要致龋菌，具备黏附牙面的能力，在牙菌斑中产酸且耐酸，能使牙齿表面脱矿，进而导致龋损[1]。婴儿出生后，变形链球菌通过母亲或携带者的唾液在其口腔内定植，且定植时间越早，发生低龄儿童龋的概率越高[2]。检测变形链球菌的传统方法是培养法，将菌斑或唾液样本在选择培养基上培养分离变形链球菌后计数。这种培养分离后计数的方法只能检测活菌的数目，不能准确反映样品中细菌的总数目，而且计数结果受观察人员主观性影响较大[3]。除了培养法，其他常用的检测和鉴定变形链球菌的方法有生化检测法、免疫检测法、DNA探针法和PCR法等[4]，但这些方法具有耗时长、不能定量的缺点。

2015年刘威等发明了聚合酶螺旋反应（poly⁃merase spiral reaction，PSR）[5-6]这一新型核酸恒温扩增方法，它利用混合引物，采用Bst DNA聚合酶的链置换活性及其扩增体系，通过引物结合、延伸、解链、单链旋转、再次延伸的循环，达到等温条件下扩增核酸的目的。PSR兼具PCR法引物设计简单和LAMP法只需一种酶、反应高效的特点，首次实现了一对引物和一种酶在等温环境下的核酸扩增。为进一步提高PSR法的反应速率，引入了加速引物，通过添加加速引物可使反应时间缩短到30min之内，50min左右即可完成。在此，我们采用PSR法定量检测变形链球菌。

1 材料和方法

1.1 材料

变形链球菌及其他对照样本均来自本实验室。DNA恒温扩增试剂盒（日本荣研化学株式会社）；2×Tap MIX试剂盒、细菌基因组提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；Triton X-100（Amresco公司）；dNTP（Pharmacia公司）；NP-40（Fluka公司）；琼脂糖（Amresco公司）；Chelex-100、甜菜碱（Sigma公司）；氯化锰、硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、EDTA、硫酸铵（天津市河东区红岩试剂厂）；实时浊度仪La-320C（日本荣研化学株式会社）；分光光度计（Amersham Biosciences公司）；Wealtec Dolphin-DOC凝胶成像系统（Wealtec公司）。

1.2 聚合酶螺旋反应的扩增原理

单一PCR引物（上游引物F及下游引物B）无法在Bst DNA聚合酶及其反应体系中使靶序列得到恒温扩增，而PSR在PCR引物的基础上从靶序列上取一段序列N加到PCR引物（F和B）的5'端，构成了2条复合引物Ft和Bt，其引物组成及其在靶序列上的结合位点如图1所示，这2条引物也是PSR的主引物[7]。

PSR的体系中存在大量甜菜碱，达到反应温度时，甜菜碱会使DNA处于单双链的动态平衡，减少了酶的种类，相对提高了反应稳定性。

如图2，以靶序列上一条单链为例（另一条单链扩增机理相同），Ft的F段能特异性识别靶序列上的Fc段并与之结合（①），并在Bst DNA聚合酶作用下向3'端缺口处延伸，形成②中的DNA双链结构，该双链在甜菜碱作用下再次解链为游离的DNA单链，另一条主引物Bt的B段与其中一条单链的Bc段（另一条单链对后续反应无意义不再考虑）结合并向3'端缺口延伸（③），生成的单链会再次断开（④），而此时该单链上的Nc段与N段是反向互补的，根据碱基互补配对原则Nc段会旋转与N段结合，形成第一个勾形结构，这是PSR的起始步骤，形成的3'端缺口会被Bst DNA聚合酶用碱基填补，继续向3'端延伸（⑤），形成⑥的U形结构，而此时引物Bt的B段再结合到该结构的Bc段上，绕着U形结构向3'端延伸，展开后生成⑦的DNA双链，同样该DNA双链在甜菜碱存在的情况下解链成单链，单链的Nc段旋转与N段互补结合，再次形成一个勾形结构，并继续向3'端缺口延伸，之后会反复重复引物结合、延伸、解链、单链旋转、延伸的循环，最终会形成一系列分子大小不一的复杂结构，达到等温条件下核酸扩增的目的。

1.3 DNA模板的制备

用细菌基因组提取试剂盒制备基因组DNA，具体步骤详见说明书。

1.4 PSR引物设计

对变形链球菌gtfB基因（GenBank：JX072978.1）进行生物信息学分析，确定并设计4套PSR引物，FT、BT为主引物，IF、IB为加速引物，引物序列见表1。引物由上海生工生物科技有限公司合成。

图1 聚合酶螺旋反应的引物组成及其在靶序列上的结合位点

1.5 PSR

25μL反应混合物包括20mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、10mmol/L KCl、10mmol/L（NH4）2SO4、0.1％Triton X-100、0.8 mol/L甜菜碱、8mmol/L MgSO4、1.4mmol/L dNTP、8 U Bst DNA 聚合酶、40 pmol FT和BT、20 pmol IB和IF。于65℃恒温反应60min左右，以双蒸水为阴性对照。

图2 聚合酶螺旋反应起始过程（①～⑤）和循环过程（⑥～⑧）示意图

表1 扩增变形链球菌靶序列的4套PSR引物序列

1.6 PSR结果检测

采用实时浊度仪检测。PSR过程中发生以下反应：

其中，Mg2P2O7为白色沉淀。依据这个原理，日本荣研化学株式会社开发出实时浊度仪LA-320C，每隔6s测定反应管的浊度并绘制成曲线来判断反应的阴阳性。

2 结果

2.1 最佳引物筛选

用设计的4套引物对变形链球菌进行PSR扩增，最先发生PSR的引物组合为最佳引物。从图3可见SM2引物组最先发生PSR，说明SM2引物组的扩增效率最高，为最佳引物。

2.2 最佳温度筛选

对最佳引物组合SM2进行最佳温度筛选，温度从60～67℃，梯度为1℃，从图4可见65℃时最先发生PSR，因此将最佳温度定为65℃。

2.3 最佳引物的特异性实验

阴性对照以水为模板，阳性对照以变形链球菌基因组为模板，并以金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、鲨鱼弧菌、嗜麦芽假单胞菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、鲁氏不动杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌为对照检测特异性。从图5可见，只有阳性对照的曲线发生了上升，其他曲线均无变化，表明设计的引物SM2具有良好的特异性。

图3 最佳引物筛选实验

2.4 最佳引物的敏感性实验及实时定量方法的建立

将SM2扩增的靶序列人工导入质粒pUC18，并在大肠杆菌BL21中大量表达，提纯，定量，按1/10梯度稀释制备成用于绝对定量的标准品，用于敏感性及实时定量PSR，检测结果见图6。以浊度达到0.1所需时间计为Ct值，取拷贝数的对数与Ct值做曲线，求R2值，考察线性关系，结果见图7，拷贝数的对数与时间呈线性关系，可以用来定量检测变形链球菌。

3 讨论

人的口腔中充满细菌。在湿热的条件下，会有700多种细菌在口腔中茁壮成长，其中的变形链球菌是牙斑的主要成分之一。变形链球菌一层一层地吸附在牙齿上，形成所谓的“生物膜”。它们消耗糖类，产生酸，腐蚀牙齿的釉层，造成牙洞。变形链球菌为革兰阳性球菌，是口腔天然菌群中占比例最大的链球菌属中的一种。反复研究证实，变形链球菌可以造成啮齿类动物和灵长类动物实验性龋的动物模型，表明该菌与人类龋病密切相关。牙菌斑中生存的变形链球菌能迅速发酵多种碳水化合物而产生多量酸，可使局部pH值下降至5.5以下。变形链球菌耐酸性强，在pH4.5的条件下仍能存活并产酸，局部pH值下降维持相当长时间，避开唾液的缓冲作用，从而造成局部硬组织脱矿，龋病病变过程开始。变形链球菌能以蔗糖为底物合成胞外葡聚糖、果聚糖及胞内多糖。葡聚糖介导细菌的黏附，促进菌斑的形成，是变链链球菌重要的致龋毒力因子。该菌合成的水溶性葡聚糖、果聚糖、胞内多糖还可作为代谢底物提供能量，增强致龋力。变形链球菌表面蛋白和脂磷壁酸是菌体表面黏结素，它们与获得性膜中的不同受体结合，促进该菌黏附和菌斑的形成。变形链球菌不仅是冠部龋病的主要致病菌，也是根部龋的主要致病菌。由此，变形链球菌成为研究的热点。

图4 最佳温度筛选实验

图5 最佳引物特异性实验

图6 最佳引物敏感性浊度法实验

图7 拷贝数的对数与时间的线性关系

近年，聚合酶螺旋反应逐渐发展成熟，在现场诊断和检测方面取得了很多成绩，尤其是在检验检疫部门和卫生医疗单位得到了充分应用。PSR具备引物简单、操作便捷、耗时短、灵敏度高、特异性强等一系列优点，再加上恒温条件，可以说无需专业操作人员也能实施现场检测。本研究对PSR技术进一步延伸，利用其定量的特点来检测变形链球菌，可以为下一步实时检测口腔内变形链球菌的数量变化打下良好的基础。

[1] Tanzer J M,Livingston J,Thompson A M.The micro⁃biology of primary dental caries in humans[J].J Dent Educ,2001,65（10）:1028-1037.

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[7] 董德荣.一种新型核酸恒温扩增方法的研究及其在现场检测中的应用[D].北京:军事医学科学院,2016.

Establishment of Quantitative Detection of Streptococcus mu⁃tans by Real-Time Quantitative PSR Method

DING Liang,LI Zhi-Xiang,WANG Hui-Yuan,XIAO Gang,GUO Qing-Yu*
Xi'an Jiaotong University Stomatological Hospital,Xi'an 710004,China
*Corresponding author,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn

Objective:To establish the polymerase spiral reaction（PSR） real-time quantitative method for detec⁃tion of Streptococcus mutans in oral cavity.Methods:The 4 sets of primers for S.mutans gtfB genes were de⁃signed and subjected to the PSR to select the optimal set,and then the result was determined by the real-time turbidity method and chromogenic method.Results:The best primer from 4 sets of primers was selected out,and the best temperature was determined to be 65℃.The specificity was indicated by the further experiments showing that there was no cross reaction with 13 other pathogen nucleic acid with the best primers.The sensitivity is up to 10 copies/μL.Conclusion:We established the PSR method of real-time quantitative detection of S.mutans.This method has the characteristic of simpleness and quickness,strong specificity and high sensitivity,which pro⁃vides a new method for real-time quantitative detecting S.mutans.

polymerase spiral reaction;Streptococcus mutans;dental caries;real-time quantitative

Q78;R378

A

1009-0002（2017）04-0519-05

2016-12-19

陕西省科技统筹创新工程计划（2015KTCL03-07）

丁良（1986- ），男，硕士研究生，（E-mail）guomuding@163.com

郭青玉，（E-mail）guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.023