呼吸道感染住院患儿Merkel细胞多瘤病毒检测及临床研究

魏田力，郑文芝，麻粉莲，姚立红，陈爱珺，崔红，郑丽舒

1.首都医科大学 附属北京友谊医院儿科，北京 100050；2.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 100052

呼吸道感染住院患儿Merkel细胞多瘤病毒检测及临床研究

魏田力1，郑文芝2，麻粉莲2，姚立红2，陈爱珺2，崔红1，郑丽舒2

1.首都医科大学 附属北京友谊医院儿科，北京 100050；2.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 100052

目的：了解北京地区Merkel细胞多瘤病毒（MCPyV）在呼吸道感染住院儿童中的流行情况和临床特点。方法：采集北京友谊医院儿科呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物样本200份，并收集相应的患儿临床资料，采用Taq⁃Man real-time PCR方法检测MCPyV LTAg基因，并经测序确认；MCPyV阳性样本同时检测常见的人呼吸道病毒混合感染情况。结果：200份标本中共检出MCPyV阳性6例，检出率3％；感染儿童年龄从6月到5岁，其中年龄≤3岁的占83.3％（5/6）。诊断包括支气管肺炎和急性支气管炎，临床表现包括发热、咳嗽、喘息。6例阳性样本均与其他呼吸道病毒混合感染，A型流感病毒和呼吸道合胞病毒混合感染最常见，6例阳性样本MCPyV载量均低于10拷贝/μL。结论：real-time PCR方法检测呼吸道感染住院患儿中MCPyV的感染率为3％，6例MCPyV阳性样本均与其他呼吸道病毒混合感染且MCPyV载量较低，不能认为MCPyV是儿童呼吸道感染的病因。

Merkel细胞多瘤病毒；TaqMan探针实时荧光定量PCR；呼吸道感染

人多瘤病毒（huamn polyomavirus，HPyV）为闭合环状双链DNA病毒，因其能诱导机体产生多种肿瘤而得名，包括1971年发现的BKPyV、JCPyV,以及2007年以来发现的WUPyV、KIPyV、MCPyV、TSPyV、HPyV6、HPyV7、HPyV9、HPyV10、STLPyV、HPyV12和NJPyV等[1]，不同的多瘤病毒感染不同的靶器官并导致神经系统、呼吸系统、泌尿生殖系统及消化系统等疾病[2]。Merkel细胞癌（Merkel cell carcinoma，MCC）是一种罕见的、侵袭性的神经内分泌来源的皮肤肿瘤，主要发生于老年人和免疫缺陷病人。2008年，Feng等应用数字转录消减技术，在MCC组织中检测到Merkel细胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus，MCPyV），并证明MCPyV与MCC相关[3]。 随后，在各种样本中均检出MVPyV的基因片段，包括皮肤、呼吸道分泌物、肠道和肿瘤组织，在免疫抑制病人的血液中也存在[4-7]。虽然对MCPyV的分子生物学特征已有所了解，但是其与宿主之间的相互影响还不是很清楚，需要研究更多的关于人多瘤病毒的生物学和流行病学资料。TaqMan探针实时定量PCR检测方法有较好的灵敏度和特异性，可以直接对产物进行定量，且操作简单自动化程度高。本研究建立了MVPyV LTAg基因的核酸Taq⁃Man探针实时定量PCR检测方法，对200份呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本进行了检测和MCPyV的流行病学分析。

1 材料与方法

1.1 采样对象

2014年1～4月于北京友谊医院儿科采集200例[男112例，女88例，性别比例1.44∶1，中间年龄为24个月（3d～14岁）]14岁以下呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物（NPA）样本200份，并收集相应的患儿临床资料，所有收集的样本经过患儿父母的知情同意。NPA样本采集后送到中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，-80℃保存备用。

1.2 检测方法的建立与评价

1.2.1 核酸提取 常规处理收集的NPA样本，用QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取200份NPA中的病毒总核酸。

1.2.2 TaqMan real-time PCR方法的建立 利用在线软件（http://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/）设计引物和探针，McPyV LTAg为靶基因。上游引物为McPyV-F（5′-TCTGGGTAT GGGTCCTTCTC-3′），下游引物为 McPyV-R（5′-C ATGGTGTTCGGGAGGTATATC-3′），荧光探针为McPyV-P（FAM-ACTGGGAGTCTGAAGCCTGGGATAMRA），扩增产物长度为79bp。GenBank BLAST评价引物和探针的特异性。引物和探针均由Invitrogen公司合成。采用ABI公司的荧光定量检测试剂盒（TaqMan Gene Expression）进行扩增，20μL 反应体系包括 2×TaqMan Gene Expres⁃sion Master Mix 10μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各 1.8μL，探针（10 pmol/μL）0.2μL，模板2μL，无 RNA 酶双蒸水 4.2μL。反应条件：50℃2min，95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。实时荧光定量PCR仪型号为MX3005P（Agilent Stratagene）。

1.2.3 TaqMan real-time PCR方法的灵敏性、特异性和可重复性评价 反应产物与pMD18-T载体连接为pMD18-T/MC，提取质粒测序正确后测定质粒浓度，计算拷贝数。1/10梯度稀释质粒pMD18-T/MC，分别以 1010～100拷贝/μL 为模板进行扩增反应，检测方法的灵敏性。将本科室保存的其他多瘤病毒（HPyV6、WUPyV、KIPyV、JCPyV）阳性核酸样本作为待检样本，用MCPyV的引物探针在相同反应条件下进行扩增，同时设阴性（无RNA酶双蒸水）和阳性（pMD18-T/MC质粒）对照，评价检测方法的特异性。用5个浓度（107～103拷贝/μL）的pMD18-T/MC质粒为模板进行扩增，每个浓度重复4次，分别计算Ct值的均数、标准差和变异系数（CV），评价检测方法的可重复性。

1.3 临床样本NPA的检测和流行病学分析

用上述建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法检测200份NPA样本核酸，对阳性样本进行测序鉴定。用普通PCR方法检测确认的MCPyV阳性样本与常见呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒（RSV），人 偏 肺 病 毒（HMPV），人 博 卡 病 毒（HBoV），流感病毒（Flu）A、B、C，副流感病毒1～4（PIV1～4），人 冠 状 病 毒（HCoV-229E、HCoVOC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1）的共感染性，以及与WUPyV和KIPyV的共感染情况[8]。对收集的临床资料进行分析。

2 结果

2.1 TaqMan real-time PCR方法的灵敏性、特异性和可重复性分析

以不同浓度梯度的质粒pMD18-T/MC为模板进行real-time PCR，获得扩增曲线，检测灵敏度为 1 拷贝/μL，检测线性范围为 1010～100拷贝/μL，阴性对照无扩增信号（图1A）；标准曲线R2=0.997，表明线性关系较好（图1B）。用建立的方法对本科室保存的其他多瘤病毒（HPyV6、WUPyV、KIPyV、JCPyV）阳性样本进行PCR扩增，仅阳性对照pMD18-T/MC质粒出现扩增曲线，其他样本及阴性对照均未出现阳性扩增曲线（图2），表明本方法具有较好的核酸扩增特异性。对5个不同浓度梯度（107～103拷贝/μL）的pMD18-T/MC质粒模板重复扩增检测4次，Ct值变异系数均小于1.5％，证明该方法稳定性和可重复性较好（表1）。

图1 MCPyV TaqMan real-time检测的灵敏性分析和标准曲线

2.2 NPA样本的MCPyV检测和流行病学分析

200份NPA样本共检出MCPyV阳性样本6例（3％），包括2名男性患儿（2/112，1.8％）和4名女性患儿（4/88，4.5％），感染儿童年龄从6个月到5岁，大部分为婴幼儿，年龄≤3岁的占83.3％（5/6）。阳性婴幼儿主要诊断为支气管肺炎和急性支气管炎，症状包括发热、咳嗽、喘息。6例MCPyV阳性样本在NPA中的病毒载量均小于10拷贝/μL，结果见表2。

2.3 MCPyV阳性样本与其他呼吸道病毒混合感染情况

6例MCPyV阳性样本均与其他呼吸道病毒混合感染，混合感染率为100％。其中A型流感病毒和RSV是最常见的混合感染，混合感染率分别为66.7％（4/6）和50％（3/6）。在混合感染中，最常见两重混合感染，占50％（3/6），三重和四重混合感染分别为33.3％（2/6）、16.7％（1/6），结果见表3。

图2 MCPyV TaqMan real-time检测的特异性

表1 MCPyV TaqMan探针实时定量PCR方法可重复性分析

3 讨论

多瘤病毒科的病毒是感染人类的最小病毒之一，基因组长度和粒径大小均相似，直径40～45nm，无包膜的二十面体病毒粒子包括5000bp大小的环形双链DNA基因组。基因组分为3个区域，即非编码控制区（NCCR），编码大T和小T抗原的早期基因和编码衣壳蛋白VP1、VP2、VP3的晚期基因[9]。目前，HPyV家族有13个成员，包括1971年分离到的BKPyV和JCPyV，以及2007年以来检测到的KIPyV、WUPyV等11种人多瘤病毒。发现WUPyV和KIPyV以来，世界各地的呼吸道样本中都检测到病毒序列，表明这2种病毒在呼吸道疾病人群中广泛传播[10]。人多瘤病毒中只有2种与人类特异性疾病相关：MCPyV与MCC相关[3]，MCC为罕见的皮肤病，在老年人和免疫抑制人群中常见；TSPyV与罕见的免疫缺陷病人的滤泡性皮肤病trichodysplasia spinulosa相关[11]。因为多瘤病毒数量在增加，因此其在疾病中的作用受到广泛关注。

血清学研究表明，非MCC的健康成人MCPyV血清抗体阳性率为88％和57.9％，小于10岁的儿童MCPyV血清抗体阳性率为25％[12-13]，表明儿童期就已暴露于MCPyV。由于很多HPyV的初次感染发生在婴幼儿时期，作为探讨MCPyV对呼吸道致病性的第一步，我们用基于TaqMan探针的实时荧光定量方法检测了呼吸道感染住院儿童NPA中的MCPyV感染情况。住院患儿200份NPA的MCPyV检测率为3％，与另外2项NPA中的检测结果类似（3/140，2.1％[14]；27/635，4.25％[15]），但低于意大利研究者对下呼吸道感染住院病人的呼吸道样本的检出率（15/87，17.24％）[16]。本研究显示MCPyV主要在3岁以内的儿童中检出，最常见的症状是咳嗽和发热。6名MCPyV阳性患儿均与其他常见的呼吸道病毒共感染,A型流感病毒和RSV最常见。其中2名MCPyV感染儿童与另一种呼吸道感染较为常见的多瘤病毒WUPyV共感染。在本研究中，MCPyV的病毒载量较低，均低于10拷贝/μL，且均与其他呼吸道病毒共感染，还不能表明MCPyV的是住院儿童呼吸道感染的病因。虽然不能肯定MCPyV是通过呼吸道传播，但间接表明呼吸道是其可能的传播途径。关于MCPyV可能的分泌和传播途径，最近的研究表明环境样本（门把手、自动售票机）中75％能检测到病毒DNA。用DNA酶处理后进行病毒载量检测，5％的MCPyV DNA被保护，可导致MCPyV潜在感染[17]。此外，TSPyV、HPyV6、HPyV7和MCPyV在健康人的皮肤上可被检出，在采集呼吸道样本时要防止样本污染。

尽管MCPyV在NPA的检出率较低为3％，但本研究表明了其有可能的传播模式。核酸扩增和检测技术的快速发展导致了病毒发现的革命性改变，在过去的几年中发现了多种新的多瘤病毒，这一趋势在未来几年内是否会延续尚待分晓，这些新发现的多瘤病毒对人的致病性也需要进一步的研究。

表2 MCPyV阳性呼吸道感染儿童的临床特点

表3 MCPyV与其他常见呼吸道病毒混合感染情况

[1] Peng J,Li K,Zhang C,et al.MW polyomavirus and STL polyomavirus present in tonsillar tissues from chil⁃dren with chronic tonsillar disease[J].Clin Microbiol Infect,2016,22（1）:97.e1-3.

[2] Dalianis T,Hirsch H H.Human polyomaviruses in dis⁃ease and cancer[J].Virology,2013,437（2）:63-72.

[3] Feng H,Shuda M,Chang Y,et al.Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma[J].Science,2008,319:1096-1100.

[4] Dang X,Bialasiewicz S,Nissen M D,et al.Infre⁃quent detection of KI,WU and MC polyomaviruses in immunosuppressed individuals with or without progres⁃sive multifocal leukoencephalopathy[J]. PLoS One,2011,6（3）:e16736.

[5] Loyo M,Guerrero-Preston R,Brait M,et al.Quantita⁃tive detection of Merkel cell virus in human tissues and possible mode of transmission[J].Int J Cancer,2010,126（12）:2991-2996.

[6] Schowalter R M,Pastrana D V,Pumphrey K A,et al.Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin[J].Cell Host Microbe,2010,7（6）:509-515.

[7] Wieland U,Mauch C,Kreuter A,et al.Merkel cell polyomavirus DNA in persons without merkel cell car⁃cinoma[J].Emerg Infect Dis,2009,15（9）:1496-1498.

[8] Zheng W Z,Wei T L,Ma F L,et al.Human poly⁃omavirus type six in respiratory samples from hospital⁃ized children with respiratory tract infections in Bei⁃jing,China[J].Virol J,2015,12（1）:166.

[9] van Ghelue M,Khan M T,Ehlers B,et al.Genome analysis ofthe new human polyomaviruses[J].Rev Med Virol,2012,22（6）:354-377.

[10]Babakir-Mina M,Ciccozzi M,Perno C F,et al.The novelKI,WU,MC polyomaviruses:possiblehuman pathogens[J]?New Microbiol,2011,34（1）:1-8.

[11]van der Meijden E,Janssens R W,Lauber C,et al.Discovery ofa new human polyomavirusassociated with trichodysplasia spinulosa in an immunocompro⁃mized patient[J].PLoS Pathog,2010,6（7）:e1001024.

[12]Pastrana D V,Tolstov Y L,Becker J C,et al.Quanti⁃tation of human seroresponsiveness to Merkel cell poly⁃omavirus[J].PLoS Pathog,2009,5（9）:e1000578.

[13]Vahabpour R,Aghasadeghi M R,Salehi-Vaziri M,et al.Prevalence of Merkel cell polyomavirus in Tehran:an age-specific serological study[J].Iran Red Crescent Med J,2016,18（5）:e26097.

[14]Kantola K,Sadeghi M,Lahtinen A,et al.Merkel cell polyomavirus DNA in tumor-free tonsillar tissues and upper respiratory tract samples:implications for respi⁃ratory transmission and latency[J].J Clin Virol,2009,45:292-295.

[15]Goh S,Lindau C,Tiveljung-Lindell A,et al.Merkel cell polyomavirus in respiratory tract secretions[J].Emerg Infect Dis,2009,15（3）:489-491.

[16]Babakir-Mina M,Ciccozzi M,Lo Presti A,et al.Iden⁃tification ofMerkelcellpolyomavirusin the lower tract of Italian patients[J].J Med Virol,2010,82（3）:505-509.

[17]Foulongne V,Courgnaud V,Champeau W,et al.De⁃tection of Merkel cell polyomavirus on environmental surfaces[J].J Med Virol,2011,83（8）:1435-1439.

Clinical Study and Detection of Merkel Cell Polyomavirus in Hospitalized Children with Respiratory Tract Infection

WEI Tian-Li1,ZHENG Wen-Zhi2,MA Fen-Lian2,YAO Li-Hong2,CHEN Ai-Jun2,CUI Hong1*,ZHENG Li-Shu2*
1.Department of Pediatrics,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050;2.National Institute for Viral Disease Control and Prevention,China CDC,Beijing 100052;China
*Co-corresponding authors,ZHENG Li-Shu,E-mail:zhenglishu2000@sina.com;CUI Hong,E-mail:cuihong100@sina.com

Objective:To investigate the prevalence and clinical features of Merkel cell polyomavirus（MCPyV）in hospitalized children with respiratory tract infection（RTI） in Beijing.Methods:A total of 200 nasopharyngeal aspirates（NPA） were collected from hospitalized children with RTI in Beijing Friendship Hospital.LTAg gene of MCPyV was detected with an established TaqMan real-time PCR and confirmed by sequencing.All the MCPyV-positive specimens were screened for other common respiratory viruses.Results:The prevalence of MCPyV was 3％（6/200）,the infected children ranged in age from 6 month to 5 years and children ≤3 years of age accounted for 83.3％（5/6） of cases.6 MCPyV-positive patients were diagnosed with bronchopneumonia and acute bronchitis.The most common symptoms were cough,fever and asthma.All 6 MCPyV-positive patients were coinfected with other respiratory viruses,of which influenza virus A and respiratory syncytial virus were most common.Additional⁃ly,their viral loads were lower than 10 copies/μL NPA specimen.Conclusion:The prevalence of MCPyV was 3％in NPA specimens from hospitalized children with RTI,measured by real-time PCR.Regarding the 100％coin⁃fection rate and the low viral load,MCPyV is not considered to be the cause of respiratory diseases.

Merkel cell polyomavirus（MCPyV）;TaqMan real-time PCR;respiratory infection

R373;Q78

A

1009-0002（2017）04-0510-05

2017-02-11

魏田力（1973- ），女，主治医师，（E-mail）denysu2003@163.com

郑丽舒，（E-mail）zhenglishu2000@sina.com；崔红，（E-mail）cuihong100@sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.021