qRT-PCR快速检测汉滩病毒抗体中和活性实验方法的建立

张晓晓，张尧，冯伟，程林峰，王芳，应旗康，马瑞雪，马铁军，刘梓谕，刘蓉蓉，张亮，叶伟，张芳琳，徐志凯，吴兴安

第四军医大学 a.微生物学教研室；b.学员旅；陕西 西安 710032

qRT-PCR快速检测汉滩病毒抗体中和活性实验方法的建立

张晓晓a，张尧b，冯伟b，程林峰a，王芳a，应旗康a，马瑞雪a，马铁军a，刘梓谕a，刘蓉蓉a，张亮a，叶伟a，张芳琳a，徐志凯a，吴兴安a

第四军医大学 a.微生物学教研室；b.学员旅；陕西 西安 710032

目的：建立一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法，快速、定量检测汉滩病毒感染中的中和抗体活性。方法：将本室前期制备的抗汉滩病毒高中和活性鼠源性单抗3G1、鼠/人嵌合单抗1D9和感染剂量为100 TCID50的病毒混合液于37℃孵育1h后感染Vero-E6细胞，提取细胞总RNA。根据GenBank数据库中汉滩病毒76-118株S基因序列设计特异性引物，在上述实验基础上以细胞总RNA为检测样品，建立qRT-PCR快速、定量检测汉滩病毒感染中中和抗体活性的实验方法。结果和结论：建立了一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法，可定量测定汉滩病毒感染中的中和抗体活性，该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。

汉滩病毒；qRT-PCR；中和抗体；微量中和实验；肾综合征出血热

汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），汉坦病毒属（Hantavirus），是一种分节段的负链RNA病毒。基因组分为L、M、S三个片段，分别编码病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein，GP，包括Gn和Gc）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）[1]。在临床上主要引起以发热、出血、急性肾功能损害和免疫功能紊乱为突出表现的肾综合征出血热（hemorrhag⁃ic fever with renal syndrome，HFRS）[2]。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，该病具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点。由于HFRS的宿主广泛，传播途径多，迄今临床上尚缺乏特异有效的治疗药物，因此其防治任务十分艰巨。而特异性疫苗是目前预防HFRS的最主要措施之一[3]，因此准确、高效地测定其中和抗体效价成为评价疫苗有效性以及检测人群对HTNV感染后免疫力的关键。目前常用于检测病毒中和抗体的方法主要是微量细胞中和实验，是病毒中和抗体检测的“金标准”[4]。然而，由于宿主细胞感染HTNV后一般不出现细胞病变效应（cytopathic ef⁃fect，CPE），结果判定比较困难；且检测时间较长，一般为9～13d，这些都极大地限制了利用传统的微量细胞中和实验方法检测HTNV中和抗体的作用。因此，研究一种方便、快捷、高通量的测定中和抗体中和作用的方法显得十分必要。

我们根据HTNV 76-118株S基因保守区设计了一对特异性引物，利用实时荧光定量PCR方法建立了一种快速、准确测定HTNV中和抗体中和作用的实验方法，从而为HFRS新型疫苗的研究和评价奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

非洲绿猴肾细胞Vero-E6购于中国科学院上海细胞库；无血清培养基DMEM购于Hyclone公司；胎牛血清购于上海生工生物工程公司；One-Step PrimeScript RT-PCR Kit购自TaKaRa公司；总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

HTNV 76-118株为本实验室保存；1A8为抗HTNV NP特异性高亲和力鼠源性单抗；3G1为抗HTNV高中和活性鼠源性单抗；1D9是本室以3G1为基础构建而成的抗HTNV鼠/人嵌合单抗，也具有高中和活性，均为本室制备保存。

细胞培养瓶购自Thomson公司；LightCycler96实时荧光定量PCR仪购自Roche公司；IX71倒置荧光显微镜购自Olympus公司；MX3000P实时荧光定量PCR仪购自Stratagenen公司。

1.2 HTNV感染的微量细胞中和实验

将Vero-E6细胞接种于1块96孔板，于37℃孵箱中培养24h，待细胞培养至单层后备用。用DMEM培养基将HTNV（TCID50=10-5.89）稀释至100倍 TCID50，并分别稀释单抗 3G1、1D9 至 10μg/mL，将稀释后的病毒液分别与DMEM、单抗3G1、单抗1D9等体积混合后于37℃孵育1h，将孵育后的混合液替换E6单层细胞的培养液，96孔板每孔加入100μL混合液，每组8个复孔，同时设置空白对照孔。37℃孵育90min后更换正常的完全培养基继续培养。96孔板每隔3d换液一次。第10d将96孔板于37℃和-80℃交替冻融3次，取裂解上清，用包被有抗HTNV NP的单抗1A8的酶标板夹心ELISA检测。

1.3 基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法

将Vero-E6细胞接种于2块24孔板，微量细胞中和实验方法同1.2。24孔板每孔加入500μL混合液，每组10个复孔，同时设置空白对照孔。37℃孵育90min后更换正常的完全培养基继续培养。每隔24h提取病毒感染组、单抗3G1混合组、单抗1D9混合组、正常细胞组各1孔细胞总RNA，共提取10d，反转录成cDNA后于-80℃冻存备用。

1.3.1 荧光定量PCR引物的设计、合成 根据HTNV 76-118株（GenBank登录号为M14626.1）的S基因序列，利用Oligo6.0软件及NCBI Blast分析设计了一对特异性引物。上游引物为HTNV-F（5'-GAGCCTGGAGACCATCTG-3'），下游引物为HTNV-R（5'-CGGGACGACAAAGGATGT-3'），引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3.2 验证PCR引物的有效性 以HTNV cDNA为模板，用HTNV-F/R特异性引物进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，确定引物的有效性。

1.3.3 荧光定量PCR反应条件的建立 将从24孔板收取的转录产物进行Real-time PCR扩增，反 应 体 系 为 25μL[SYBR Premix ExTaq（2×）12.5μL，HTNV-F（10μmol/L）和 HTNV-R（10μmol/L）各1μL，模板2μL，用ddH2O补足]。反应条件：95℃预变性 10s，95℃变性 5s，60℃退火/延伸20s，每个循环退火延伸结束时检测荧光信号，共40个循环。在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪自动绘制线性标准曲线。反应结束后先加热至95℃，然后降至72℃，开始以0.2℃/s递增加热至95℃，检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。每次实验均设立1个空白对照即不加模板，当空白对照为阴性时实验有效。Ct值≤30为阳性，Ct值＞30为阴性。

2 结果

2.1 微量细胞中和实验

培养10d后，将微量细胞中和实验的96孔板于37℃和-80℃反复冻融3次，取裂解上清作为待检样品，用单抗1A8作为包被抗体，ELISA检测抗体的中和活性。结果显示HTNV 76-118分别和单抗3G1、单抗D9孵育后感染细胞，细胞中残留的HTNV 76-118明显减少，表明上述特异性单克隆抗体均能有效抑制HTNV在细胞中的感染和复制（图1）。

2.2 基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法

2.2.1 引物有效性验证 以HTNV的cDNA为样品，PCR扩增HTNV S基因片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，可见在1300bp左右有一条明亮条带，大小与预期相符（图2）。

2.2.2 改良法qRT-PCR结果 将每隔24h从24孔板中提取的细胞总RNA反转录成cDNA后，实时定量PCR检测病毒基因。结果显示感染24h后，中和抗体组（单抗3G1、单抗1D9）与HTNV 76-118孵育组病毒量明显低于病毒感染组，与经典的细胞微量中和实验结果相符。感染4d后病毒感染组的病毒量显著增长，而中和抗体组病毒增量不大，因此，可以选择感染后第4d作为最佳检测时间，与传统的微量细胞中和实验检测方法相比大大缩短了检测周期。见图3。

3 讨论

目前研究中的HTNV新型疫苗种类较多，疫苗接种后产生中和抗体的能力是评价其保护效应的重要指标[5]，而且流行病学调查也须检测人群中中和抗体水平。国内外已建立了多种中和抗体活性检测方法，如过氧化物酶抗过氧化物酶（peroxidase-anti-peroxidase，PAP）法[6-7]、病毒空斑减少中和实验（plaque reduction neutralizaion test，PRNT）[8]、微量细胞中和实验等。上述方法前期病毒感染过程基本相同，而后期检测各有特色。PAP法在感染3～5d后即可用冷甲醇或丙酮固定细胞，通透后依序加入对应的抗体，用DAB显色后通过染色细胞计数。该法所需时间较短，且有一定的定量作用，但操作繁琐，主观性强。PRNT法是一种敏感度较高，可定量的抗体中和活性检测方法，它是将病毒与抗体的混合液加入预先培养的受体细胞中，用空斑计数测定其中和滴度。该方法耗时长，通量低，主观性强，而且在测定过程中对HTNV的活性和敏感性要求较高。由于HTNV增殖周期长，且缺乏明显的CPE，微量细胞中和实验是现在最常用的中和活性检测方法之一。此方法通常在病毒感染细胞9d后用双抗体夹心ELISA法或荧光细胞中和法进行检测，同样有耗时长、通量低等缺陷。因此，急需发展快速有效的方法来进行HFRS流行病学调查和评价HFRS新型疫苗保护效应。

图1 微量细胞中和实验结果

图2 反转录扩增产物电泳图

图3 qRT-PCR检测微量细胞中和实验结果

近几年，利用qRT-PCR检测中和抗体中和作用在病毒疫苗滴度检测方面得到广泛推广，如麻疹病毒疫苗、轮状病毒疫苗及痘病毒疫苗等[9-10]。目前，实时荧光定量PCR检测方法分为染料法和探针法，这2种方法都已被证实比常规RT-PCR更快速、灵敏[11]。SYBR GreenⅠ是一种双链DNA结合染料，可以与任何双链DNA结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低、敏感度高。探针法则是通过探针偶联不同荧光基团而同时进行多重检测，但相对成本较高。本研究中，我们对汉滩病毒的全基因组序列进行了分析，针对其保守的S基因设计一对引物，建立了一种SYBR GreenⅠRealtime PCR方法，可快速测定汉滩病毒感染中中和抗体活性，在感染24h后病毒量甚微时即可定量检测到病毒核酸。结果显示病毒感染组的病毒载量（8.047×10-3）高于单抗 3G1（1.96×10-3）和 1D9组（3.01×10-3），之后48和72h的后续检测结果皆延续了此趋势。感染4d后病毒组的病毒量有显著增长，而中和抗体组病毒量增量不大。对感染第5～7d的样本进行持续检测，病毒感染组病毒增长速度变缓，与第4d的检测结果相似。但第8d后病毒感染组的病毒载量呈下降趋势，其原因可能是细胞在24孔板内生长8d后密度过高，细胞状态下降导致通过细胞提取的核酸质量不高，影响了检测结果。因此，可选择感染后第4d作为最佳检测时间。与传统方法相比，本实验通过荧光标记放大了病毒感染信号，从而大大提高了检测灵敏度，缩短了检测时间。同时，在结果判读方面减少了人为误差，更加确实可信。

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Establishment of a qRT-PCR Method for Quick Detection of Neutralizing Antibody Activity of Hantaan Virus

ZHANG Xiao-Xiaoa,ZHNAG Yaob,FENG Weib,CHENG Lin-Fenga,WANG Fanga,YING Qi-Kanga,MA Rui-Xuea,MA Tie-Juna,LIU Zi-Yua,LIU Rong-Ronga,ZHANG Lianga,YE Weia,ZHANG Fang-Lina,XU Zhi-Kaia,WU Xing-Ana*
a.Department of Microbiology;b.Student Brigade;Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
*Corresponding author,E-mail:wuxingan@fmmu.edu.cn

Objective:To develop a fast and accurate evaluation system for neutralization antibodies against Han⁃taan virus.Methods:Vero-E6 cells were incubated at 37℃for 1 hour in the presence of Hantaan virus at 100 TCID50infectious dose and candidate antibody（mAb 3G1 or murine/human chimeric mAb 1D9）.The total cellular RNAs from the incubation mix were extracted.The specific primers were designed according to the S gene se⁃quence of Hantavirus 76-118 in the GenBank database.The extracted total RNAs as template,qRT-PCR was per⁃formed to detect the effect of neutralization antibodies for Hantaan virus.Results& Conclusion:The method called qRT-PCR-based micro-cell-neutralization test was successfully established,which is capable to quantify the neutralizing antibodies rapidly and acurrately.

Hantaan virus;qRT-PCR;neutralization antibody;micro-neutralization test;hemorrhagic fever with renal syndrome

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0524-04

2017-01-12

国家自然科学基金（31470890，31270978）；陕西省科技统筹创新工程计划（2013KTCL03-06）；军队重点课题（BWS13G024）

张晓晓（1985-），女，微生物学硕士，（E-mail）281166325@qq.com

吴兴安，（E-mail）wuxingan@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.024