带有小鼠CD40L基因的汉滩病毒糖蛋白表达载体的构建

冯伟，张尧，张晓晓，应旗康，刘梓谕，吴兴安，王芳

1.第四军医大学 学员旅，陕西 西安 710032；2.第四军医大学 微生物学教研室，陕西 西安 710032

带有小鼠CD40L基因的汉滩病毒糖蛋白表达载体的构建

冯伟1，张尧1，张晓晓2，应旗康2，刘梓谕2，吴兴安2，王芳2

1.第四军医大学 学员旅，陕西 西安 710032；2.第四军医大学 微生物学教研室，陕西 西安 710032

目的：构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体，并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因，检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果：参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物，通过聚合酶链反应（PCR）获得M和CD40L基因片段，将其与pCI-neo载体相连，测序证实该载体构建成功后，将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO-K1中，利用间接免疫荧光法（IFA）检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论：构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达，为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。

汉滩病毒；包膜糖蛋白；CD40L

汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，为分节段的负链RNA病毒，病毒基因组按片段大小分为L、M、S等3个片段，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-depen⁃dent RNA polymerase，RdRp）、包膜糖蛋白（glyco⁃protein，GP）和核衣壳蛋白（nucleoprotein，NP）。GP和NP为结构蛋白，是重要的病毒抗原[1]。GP具有多个中和抗原表位，在机体的保护性体液免疫应答中起主要作用，但其诱导细胞免疫反应的能力较弱；NP具有较强的免疫原性，但其刺激产生中和抗体的能力较弱[2]。

CD40配体（CD40 ligand，CD40L）是常用的免疫刺激分子，其作为佐剂可增强抗原提呈细胞的抗原提呈能力，提高疫苗免疫效果[3]。

我们将汉滩病毒包膜糖蛋白基因与小鼠CD40L基因同时构建入真核表达载体pCI-neo中，并观察此重组质粒可否在真核细胞中表达，从而为进一步的动物免疫奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

哺乳动物细胞CHO-K1、感受态大肠杆菌JM109、含有汉滩病毒76-118株M全长基因序列的质粒pcDNA3.1-M、质粒pCI-neo由本室保存；限制性内切酶、T4DNA连接酶、凝胶回收试剂盒购自大连TaKaRa公司；转染试剂LipofectAMINE 2000购自Invitrogen公司；抗汉滩病毒GP的特异性抗体由本室制备保存；兔抗小鼠CD40L多克隆抗体购自Abcam公司；FITC标记的羊抗小鼠IgG、Cy3标记的羊抗兔IgG购自康为世纪公司。

1.2 汉滩病毒M基因片段的扩增

参照GenBank中汉滩病毒76-118株M基因核苷酸序列设计并合成1对引物，同时在引物两端分别加入MluⅠ和 XbaⅠ酶切位点。上游引物为5'-CGACGCGTATGGGGATATGGAAGTGGC-3'，下游引物为5'-GCTCTAGACTATGATTTTTTATGCTT CCTTACGGG-3'。以含有汉滩病毒M基因的质粒pcDNA3.1-M为模板进行PCR扩增（反应条件：95℃ 预 变 性 10min，以 95℃ 30s、54℃ 30s、72℃ 2.5min进行30个循环，72℃延伸10min）。

1.3 CD40L基因片段的扩增

参照GenBank中小鼠CD40L基因序列设计并合成1对引物，在引物两端分别加入StuⅠ和Csp45Ⅰ酶切位点。上游引物为5'-GAAGGCCTA TGATAGAAACATACAGCCAACCTTCCCCC-3'，下游引物为5'-GGGTTCGAATCAGAGTTTGAGTAAG CCAAAAGATGAGAAG-3'。将CD40L基因从StuⅠ和Csp45Ⅰ两个位点插入pCI-neo-M载体替换neo基因，确保CD40L基因与M基因在该载体上同时表达。

1.4 pCI-neo-M-CD40L在真核细胞中的表达及鉴定

采用脂质体法将重组质粒于体外转染至已长至单层的CHO-K1细胞中，转染后48h取出细胞爬片，冲洗后分别与一抗（抗HTNV GP鼠单克隆抗体，兔抗小鼠CD40L多克隆抗体）及二抗（FITC标记的羊抗小鼠IgG和Cy3标记的羊抗兔IgG）结合，最后与DAPI染液结合（细胞核定位染液），同时设对照组。

2 结果

2.1 重组质粒pCI-neo-M的构建及鉴定

以pcDNA3.1-M质粒为模板扩增M全长基因，纯化后的PCR产物与pCI-neo载体相连，挑取阳性克隆提取质粒，经MluⅠ和 XbaⅠ双酶切后凝胶电泳得到约3400bp的目的片段（图1），与预期相符，测序证实该载体构建成功。

2.2 重组质粒pCI-M-CD40L的构建及鉴定

图1 重组质粒pCI-neo-M酶切鉴定结果

从活化的小鼠脾细胞中克隆CD40L基因，纯化后的PCR产物与pCI-neo-M载体相连，挑取阳性克隆提取质粒，经StuⅠ和Csp45Ⅰ双酶切后凝胶电泳得到约783bp的目的片段（图2），与预期相符，测序证实该载体构建成功。表明构建了带有小鼠CD40L基因的汉滩病毒糖蛋白真核表达载体（图3）。

2.3 重组质粒pCI-M-CD40L表达糖蛋白和细胞因子CD40L的检测

将重组质粒pCI-M-CD40L转染CHO-K1细胞，48h后用间接免疫荧光法（indirect immuno⁃fluorescence assay，IFA）检测目的蛋白的表达，结果如图4，GP、CD40L均有表达且GP与CD40L可共定位。

图2 重组质粒pCI-M-CD40L酶切鉴定结果

图3 重组质粒pCI-M-CD40L构建示意图

图4 重组质粒pCI-M-CD40L转染CHO细胞的间接免疫荧光结果（×400）

3 讨论

汉滩病毒在我国主要引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS），该病危害极为严重，目前尚无特效治疗药物，主要使用疫苗进行预防[4]。

CD40L主要表达于活化的CD4+T细胞表面，而CD40表达于抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，ATC）（树突细胞、B细胞、巨噬细胞等）上。CD40L与CD40的结合，一方面促进APC活化，促进共刺激分子表达和细胞因子的分泌；另一方面，由于APC表达共刺激分子和分泌促进T细胞分化的细胞因子，也促进T细胞的活化，活化的Th细胞表达的CD40L与B细胞表面的CD40结合可促进B细胞的增殖、分化，抗体生成和抗体类别转换。CD40L已作为一些病毒DNA疫苗的免疫佐剂[5-6]。

汉滩病毒糖蛋白的免疫学特性为其成为汉滩病毒核酸疫苗的候选基因提供了理论依据。因此，我们以pCI-neo为载体构建了含包膜糖蛋白基因的真核表达载体，在该载体中加入了可增强小鼠免疫刺激作用的CD40L基因，从而增强此真核表达载体对动物的免疫效果。实验结果表明真核表达载体pCI-M-CD40L构建成功，并且汉滩病毒包膜糖蛋白和CD40L可同时在真核细胞中获得表达，证明了该重组体作为汉滩病毒核酸疫苗的可行性，从而为进一步的动物免疫及汉滩病毒多价核酸疫苗的研制奠定了基础。

[1] Muyangwa M,Martynova E V,Khaiboullina S F,et al.Hantaviral proteins:structure,functions,and role in Hantavirus infection[J].FrontMicrobiol,2015,6:1326.

[2] Yoshimatsu K,Yoo Y C,Yoshida R,et al.Protective immunity of Hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus-expressed protein[J].Arch Virol,1993,130（3-4）:365-376.

[3] Barr T A,Carlring J,Heath A W.Co-stimulatory ago⁃nists as immunological adjuvants[J].Vaccine,2006,24（17）:3399-3407.

[4] Jiang H,Du H,Wang L M,et al.Hemorrhagic fever with renal syndrome:pathogenesis and clinical picture[J].Front Cell Infect Microbiol,2016,6:1.

[5] Gupta S,Termini J M,Kanagavelu S,et al.Design of vaccine adjuvants incorporating TNF superfamily li⁃gands and TNF superfamily molecular mimics[J].Im⁃munol Res,2013,57（1-3）:303-310.

[6] Kornbluth R S,Stone G W.Immunostimulatory combi⁃nations:designing the next generation of vaccine adju⁃vants[J].J Leukoc Biol,2006,80（5）:1084-1102.

CNKI推出《中国高被引图书年报》

日前，中国知网（CNKI）中国科学文献计量评价研究中心推出了一套《中国高被引图书年报》，该报告基于中国大陆建国以来出版的422万余本图书被近3年国内期刊、博硕、会议论文的引用频次，分学科、分时段遴选高被引优秀学术图书予以发布。据研制方介绍，他们统计并分析了2013-2015年中国学术期刊813万余篇、中国博硕士学位论文101万余篇、中国重要会议论文39万余篇，累计引文达1451万条。根据统计数据，422万本图书至少被引1次的图书达72万本。研制方根据中国图书馆分类法，将72万本图书划分为105个学科，分1949-2009年和2010-2014年两个时间段，分别遴选被引最高的TOP 10％图书，共计选出70911本优秀图书收入《中国高被引图书年报》。统计数据显示，这7万本高被引优秀图书虽然只占全部图书的1.68％，却获得67.4％的总被引频次，可见这些图书质量上乘，在同类图书中发挥了更加重要的作用。该报告还首次发布各学科“学科h指数”排名前20的出版单位的评价指标，对客观评价出版社的社会效益——特别是学术出版物的社会效益具有重要的参考价值。

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Construction of Hantaan Virus Envelope Glycoprotein Ex⁃pression Vector Added with Mouse CD40L Gene

FENG Wei1,ZHANG Yao1,ZHANG Xiao-Xiao2,YING Qi-Kang2,LIU Zi-Yu2,WU Xing-An2,WANG Fang2*
1.Cadet,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;2.Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032;China
*Corresponding author,E-mail:wangf07@fmmu.edu.cn

Objective:The eukaryotic expression vector of Hantaan virus glycoprotein was constructed and added with mouse CD40L gene that could strengthen mouse immune response,in order to detect whether or not it could express in the eukaryotic cell.Methods&Results:Primers were designed referring to M gene sequence of Hanta⁃an virus and mouse CD40L gene in the GenBank.Then M gene and mouse CD40L gene were obtained through PCR,and cloned into eukaryotic expressing vector pCI-neo vector.After sequenced,the eukaryotic expressing vec⁃tor was transfected into eukaryotic cells CHO-K1 with liposome method.It was found that specific fluorescence appeared in the CHO-K1 after transfection by indirect immunofluorescence assay（IFA）.Conclusion:The results showed that the eukaryotic expressing vector of Hantaan virus glycoprotein conjugated with mouse CD40L was suc⁃cessfully constructed and expressed,to deeply investigate the immune response of Hantaan virus glycoprotein.

Hantaan virus;envelope glycoprotein;CD40 ligand（CD40L）

Q78;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0499-04

2017-01-06

国家自然科学基金（31470890，31270978）；军队重点课题（BWS13G）；陕西省科技统筹创新工程计划（2013KTCL03-06）

冯伟（1994- ），男，本科在读，（E-mail）905597943@qq.com

王芳，（E-mail）wangf07@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.018