乌拉尔甘草查耳酮异构酶基因多态性分析

马永生，张晓冬，尹彦超，周姗，胡婷，高智强，刘颖

北京中医药大学 生命科学学院，北京 100102

乌拉尔甘草查耳酮异构酶基因多态性分析

马永生，张晓冬，尹彦超，周姗，胡婷，高智强，刘颖

北京中医药大学 生命科学学院，北京 100102

目的：对乌拉尔甘草黄酮代谢途径中的关键酶查耳酮异构酶（CHI）进行基因克隆及多态性分析。方法：取5株乌拉尔甘草新鲜根样，提取RNA并逆转录得cDNA，利用特异引物克隆乌拉尔甘草CHI基因，测序并对所得序列进行多态性分析。结果：共获得62条全长为690bp的乌拉尔甘草CHI基因cDNA序列，编码229个氨基酸残基。多态性分析显示62条CHI基因cDNA序列存在47个变异位点，可分为20种不同单倍型（单倍型1～20），其相似度为99.62％；氨基酸序列存在30个变异位点，可分为16种类型（AA1～AA16），一致性为98.99％。CHI基因编码蛋白为稳定性亲水蛋白，相对分子质量为24 400，等电点为5.3～6.7，二级结构以α螺旋和无规卷曲为主。同源性分析显示，该基因序列与豆科植物大豆的CHI基因亲缘性最近。结论：克隆了乌拉尔甘草CHI基因并对其进行了多态性分析，为进一步探究CHI基因对甘草苷生物合成的分子调控机制奠定基础。

乌拉尔甘草；查耳酮异构酶；甘草苷；基因克隆；多态性分析

乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）为豆科甘草属植物。2015版《中国药典》规定栽培甘草的检测指标为：甘草酸含量不低于2.0％，甘草苷含量不低于0.50％[1]，因此甘草苷是评价甘草质量的重要指标之一。大量药理学研究表明，甘草苷具有抗癌、抗糖尿病、抗病毒、抗抑郁等多种药理活性[2]。《中国药典》规定甘草有3种基原植物，即乌拉尔甘草、光果甘草（G.glabra L.）及胀果甘草（G.inflata Bat.）。本课题组前期对这3种基原甘草进行了4种主要黄酮类化合物的含量分析[3]，发现乌拉尔甘草中甘草苷含量明显高于其他2种基原植物。因此，对乌拉尔甘草中甘草苷的生物合成途径开展相关研究，将有助于揭示高甘草苷积累的分子机制。

多种酶参与甘草苷的生物合成，其中查耳酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）催化分子内环化反应，是甘草苷生物合成的关键酶之一[4]。1987年，研究者利用抗体技术首次从法国豌豆（Pisum sativum L.）中分离得到CHI基因[5]，随后陆续从矮牵牛（Petunia hybrida Vilmorin）[6]、菜豆（Phaseo⁃lus vulgaris L.）[7]、野茶树（Camellia sinensis K.）[8]等植物中克隆得到该基因。迄今，GenBank数据库中已注册了1164条植物CHI的DNA序列及278条cDNA序列。有报道显示，过表达CHI基因的甘草毛状根中黄酮类化合物的含量明显提高[9]，从而证明了CHI基因对甘草黄酮生物合成的明确影响。然而，CHI基因在同一植物中通常以多拷贝形式存在，关于CHI基因多态性对黄酮代谢途径影响的相关研究尚未见诸报道。

我们对乌拉尔甘草中甘草苷生物合成途径的关键酶基因CHI进行了克隆及多态性分析，并对其主流单倍型做生物信息学分析，以期为进一步揭示CHI基因多态性对甘草苷生物合成的影响机制奠定基础，并为筛选甘草优良基因、分子育种、提高栽培甘草质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

取5株新鲜乌拉尔甘草主根，立即液氮速冻，-80℃保存备用。大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD-19T载体、ESPY spin植物RNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、M-MLV（Rnase H-）反转录试剂盒均购于北京博迈德生物技术有限公司；LA-Taq DNA聚合酶、oligo（dT）购于TaKaRa公司。微量移液器（Eppendorf公司）；1-13000型离心机（Sigma公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；BG-gdsAUTO510型凝胶成像系统（上海培清科技有限公司）；酶标仪（Biotek Epoch公司）。

1.2 RNA提取及逆转录

取新鲜乌拉尔甘草主根于液氮中迅速研磨成细粉，取适量用ESPY spin植物RNA快速提取试剂盒逐步提取总RNA，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，用酶标仪对所得RNA的D260nm/D280nm值及浓度进行测定，以确定RNA的纯度和浓度。用M-MLV反转录试剂盒，以oligo（dT）为引物进行逆转录。

1.3 乌拉尔甘草CHI基因扩增及测序

根据文献报道[10]，用Primer 5.0设计上游引物GF（5′-ATGGCGGGAGCAGCACCAGTA-3′）、下 游引物 GR（5′-TCAGTTTCCGTTTCCAAT-3′），采用50μL反应体系[包括模板cDNA 2.0μL、10×缓冲液 5.0μL、dNTP（2.5mmol/L）5.0μL、引物 GF和 GR 各 2.0μL（5μmol/L）、LA-Taq 酶 1.0μL、无RNase的水33.0μL]进行PCR（反应程序：95℃预变性2min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存），经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，然后对产物进行胶回收纯化。将胶回收产物与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于含有氨苄西林（Amp，50 mg/L）的LB平板上培养，每个样品随机挑取20个以上单克隆进行PCR验证，阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测至饱和。

1.4 乌拉尔甘草CHI生物信息学分析

利用DNAMAN对所得CHI序列进行比对分析，利用Editseq将其翻译成氨基酸序列，通过DNASTAR7.0、ExPASy等分析其二级结构、三级结构及基本理化性质，并通过NCBI在线数据库查找其他物种的CHI序列，利用MEGA5.1构建系统进化树。

2 结果

2.1 乌拉尔甘草CHI的克隆及序列分析

共获得62条长度约为690bp的乌拉尔甘草CHI基因cDNA序列（图1），与目标条带长度一致。测序结果显示，所得62条cDNA序列长度均为690bp。DNAMAN比对结果显示62条cDNA序列中存在47个变异位点，可确定为20种单倍型（1～20），一致性为99.62％，各单倍型变异位点统计于表1。20种乌拉尔甘草CHI单倍型均编码229个氨基酸残基，可确定为16种氨基酸序列类型（AA1～AA16），一致性为 98.99％，存在 30个变异位点，详见表2。

表1 20种乌拉尔甘草CHI基因单倍型变异位点统计表

在GenBank中对20种乌拉尔甘草CHI单倍型进行注册，序列登录号及各序列所占比例见表3。在62条乌拉尔甘草CHI cDNA序列中，单倍型3为19条，出现频率最高（30.7％），为主流单倍型；单倍型3、8、13、18及20编码相同的氨基酸序列，即AA3，其所占比例可达43.5％，为主流氨基酸序列类型，推测其在甘草苷生物合成中起关键作用。

2.2 乌拉尔甘草CHI编码氨基酸序列理化性质分析

通过ExPASy在线分析了16种乌拉尔甘草CHI编码氨基酸序列的基本理化性质，结果如表4。乌拉尔甘草CHI编码蛋白由229个氨基酸残基组成，相对分子质量为24 400，等电点为5.3～6.7；总平均亲水性（GRAVY）均为负值，表明乌拉尔甘草CHI为亲水性蛋白；不稳定指数均小于40，表明其为稳定性蛋白；半衰期为30h

图1 乌拉尔甘草CHI扩增结果

表2 16种乌拉尔甘草CHI氨基酸序列变异位点统计表

2.3 乌拉尔甘草CHI的二级结构分析及三级结构预测

以主流氨基酸序列AA3为目标序列，利用DNASTAR7.0和ExPASy分析其二级结构，结果如图2，α螺旋占34.06％，β转角占11.79％，延长链占21.40％，无规卷曲占32.75％。SWISS-MODEL在线预测的AA3三级结构如图3，表明CHI含有较多的α螺旋和无规卷曲，与二级结构预测相符。

2.4 乌拉尔甘草CHI同源性分析

按照亲缘关系远近，从NCBI数据库中挑选了有代表性的17个物种的CHI氨基酸序列，利用DNAMAN将本研究获得的16条乌拉尔甘草CHI氨基酸序列与其进行序列比对分析，发现相似度最高的为豆科植物大豆（Glycine max）（75.55％），相似度最低的为单子叶植物大叶藻（Zostera mari⁃na L.）（13.28％）。利用 ClustalW1.8和 MAGA5.1，将上述33条CHI氨基酸序列构建系统进化树（图4），所有序列聚类可聚为3支，所有豆科植物聚为1支，其他双子叶植物聚为1支，单子叶植物聚为1支。在豆科植物中，16条乌拉尔甘草CHI氨基酸序列单独聚为1小支。整体而言，乌拉尔甘草CHI氨基酸序列与大豆在进化关系上相距最近，而与大叶藻和玉米在进化关系上最远，这与序列比对分析结果相符。

表3 乌拉尔甘草20种CHI单倍型GenBank登录号及所占比例

表4 乌拉尔甘草CHI编码氨基酸序列理化性质

图2 乌拉尔甘草CHI二级结构预测

图3 乌拉尔甘草CHI三级结构预测

3 讨论

甘草作为我国最常用的大宗药材之一，国内外需求量巨大。但由于野生甘草资源匮乏，近年来国务院明令禁止采挖野生甘草，因此栽培甘草已成为商品甘草的主流产品。本课题组前期对来自全国7个甘草主产区的532株两年生栽培甘草样品的调查研究显示，栽培甘草中甘草苷的含量差异十分显著，分布范围为0.058％～3.43％，且60％左右的栽培甘草中甘草苷的含量难以达到药典规定的最低标准，严重影响到栽培甘草的质量。而功能基因的多态性是影响甘草质量的重要分子基础，因此对甘草黄酮代谢途径中的关键功能基因开展研究，对于提高栽培甘草质量具有深远意义。

CHI作为黄酮类化合物生物合成的关键酶之一，是第一个被认识的类黄酮生物合成的相关酶。目前，CHI已经在矮牵牛[11]、银杏（Ginkgo bi⁃loba L.）[12]、百合（Lilium speciosum T.）[13]等多种植物中得到克隆。此外，在一些细菌和真菌中也克隆到CHI基因[14]。本研究共克隆得到62条乌拉尔甘草CHI序列，可分为20种单倍型，其一致性相对较好，为99.62％，主流单倍型为单倍型3，所占比重为30.7％。20种CHI单倍型编码16条氨基酸序列，一致性为98.99％，主流氨基酸序列类型为AA3，所占比重为43.5％，因此推测AA3在甘草苷的生物合成中起关键作用。但是，CHI在不同物种间同源性相对较低，聚类分析显示同源性相对最近的大豆CHI与本实验中所得乌拉尔甘草CHI序列的一致性也只有75.55％，因此给同源克隆造成一定的难度。

植物CHI是否表达及表达量的高低都会影响黄酮含量的变化，如缺乏CHI的玉米突变体，其查耳酮积累下降，导致玉米呈现古铜色[15]；通过对黄芩毛状根CHI基因过表达或基因沉默处理，发现其黄酮含量相应地增加或减少[16]；将红花CHI转到拟南芥中过表达，结果表明转基因拟南芥中黄酮含量比野生型拟南芥高2.3倍[17]；此外，还有研究表明，在西红柿中超量表达矮牵牛CHI，结果导致果皮中黄酮醇含量比对照品高78倍[18]。这些研究在一定程度上说明了CHI在黄酮代谢途径中的重要性。本研究克隆得到20种甘草CHI单倍型，这将为进一步分析甘草中CHI基因多态性与甘草苷生物合成的相关性，以及提高栽培甘草中甘草苷的含量奠定基础。

图4 CHI系统进化树分析

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Polymorphism Analysis of Chalcone Isomerase Gene of Glyc⁃yrrhiza uralensis Fisch.

MA Yong-Sheng,ZHANG Xiao-Dong,YIN Yan-Chao,ZHOU Shan,HU Ting,GAO Zhi-Qiang,LIU Ying*
School of Life Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China
*Corresponding author,E-mail:liuyliwd@sina.com

Objective:To clone and analyze chalcone isomerase（CHI） gene of Glycyrrhiza uralensis Fisch.Meth⁃ods:RNA was extracted from the fresh root of G.uralensis,cDNA was reversely transcribed,and then CHI was cloned using specific primers.The obtained CHI cDNA sequences were analyzed using bioinformatics.Results:Six⁃ty-two CHI cDNA sequences with a full length of 690bp were obtained.Forty-seven variable sites were present in these CHI cDNA sequences,and twenty haplotypes were determined,the similarity of which was 99.62％.Thir⁃ty variable sites were present in the amino acid sequences,and sixteen types were determined,the similarity of which was 98.99％.Bioinformatic analysis shows that G.uralensis CHI cDNA sequence has a complete open read⁃ing frame,encoding a stable hydrophilic protein with 229 amino acids.Its isoelectric point is between 5.3 and 6.7,molecular weight is about 24.4 kD.Most of secondary structure are α-helix and random coil.The homolo⁃goue analysis indicates it has the closest relationship to Glycine max.Conclusion:The CHI cDNA of G.uralensis was successfully cloned and analyzed.And we hope this work will provide a basis for exploring the function of CHI and revealing the molecular regulation mechanisms of liquiritinin biosynthesis in G.uralensis.

Glycyrrhiza uralensis Fisch.;chalcone isomerase;liquiritinin;clone;polymorphism analysis

Q943.2

A

1009-0002（2017）04-0471-07

2017-01-12

北京中医药大学杰出青年人才项目（2016JYBXJQ002）

马永生（1993- ），男，硕士研究生，（E-mail）mayscn@126.com

刘颖，（E-mail）liuyliwd@.sina.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.013